acido ialuronico D. Acido ialuronico: proprietà e ruolo biologico, uso dei preparati di acido ialuronico in medicina e cosmetologia, recensioni

Lo ialuronato (chiamato anche acido ialuronico, ialuronato o HA) è un glicosaminoglicano anionico, non solfatato, ampiamente distribuito nei tessuti connettivi, epiteliali e neurali. È unico tra i glicosaminoglicani in quanto non è solfato, si forma nella membrana plasmatica invece che nell'apparato di Golgi e può essere molto grande, con pesi molecolari che spesso raggiungono i milioni. Essendo uno dei componenti principali della matrice extracellulare, l’acido ialuronico promuove in modo significativo la proliferazione e la migrazione cellulare e può anche essere coinvolto nella crescita di alcuni tumori maligni.

Struttura dell'acido ialuronico

Le proprietà dell'acido ialuronico furono determinate per la prima volta negli anni '30 nel laboratorio di Karl Meyer.

L'acido ialuronico è un polimero di disaccaridi costituito da D-N-acetilglucosamina e acido D-glucuronico, collegati alternativamente da legami β-1,4 e β-1,3-glicosidici. L'acido ialuronico può contenere 25.000 unità disaccaridiche simili. I polimeri dell'acido ialuronico possono variare in dimensioni da 5.000 a 20.000.000 di Da in vivo. Il peso molecolare medio nel liquido sinoviale umano è di 3-4 milioni di Da; l'acido ialuronico isolato dal cordone ombelicale umano ha 3.140.000 Da.

L'acido ialuronico è energeticamente stabile, in parte a causa della stereochimica dei suoi disaccaridi costituenti. I gruppi voluminosi su ciascuna molecola di zucchero si trovano in posizioni spazialmente favorevoli, mentre le molecole di idrogeno più piccole scelgono posizioni assiali meno favorevoli.

Sintesi biologica

L'acido ialuronico è sintetizzato da una classe di proteine ​​integrali di membrana chiamate ialuronano sintasi, di cui 3 tipi si trovano nei vertebrati: HAS1, HAS2 e HAS3. Questi enzimi allungano l'acido ialuronico aggiungendo sequenzialmente N-acetilglucosamina e acido glucuronico al polisaccaride originale, trasferendo il polimero tramite il trasportatore ABC attraverso le membrane cellulari nello spazio intercellulare.

È stato dimostrato che la sintesi dell'acido ialuronico (HAS) è inibita dal 4-metilumbelliferone (Chimecromone, Heparvit), un derivato della 7-idrossi-4-metilcumarina. Questa inibizione selettiva (senza inibizione di altri glicosaminoglicani) può essere utile nel prevenire la metastasi delle cellule tumorali maligne.

Il Bacillus Subtilis è stato recentemente modificato geneticamente (OGM) per coltivare la formula per rilasciare acido ialuronico in un processo brevettato per produrre prodotti destinati all'uso umano.

Recettori cellulari per l'acido ialuronico

Finora, i recettori cellulari identificati per l’acido ialuronico sono stati divisi in tre gruppi principali: CD44, recettore per la motilità mediata da HA (RHAMM) e molecola di adesione intracellulare-1 (ICAM-1). CD44 e ICAM-1 erano già note molecole di adesione cellulare con altri ligandi consolidati prima che fosse scoperto il loro legame con GC.

Il CD44 è ampiamente distribuito in tutto il corpo e una dimostrazione formale del legame HA-CD44 è stata proposta da Aruffo et al nel 1990. Oggi è riconosciuto come il principale recettore sulla superficie cellulare dell’acido ialuronico. CD44 media l'interazione delle cellule con l'acido ialuronico e il legame di entrambi ha effetti importanti in vari eventi fisiologici come l'aggregazione cellulare, la migrazione, la proliferazione e l'attivazione; adesione cellula-cellula e cellula-substrato; endocitosi dell'acido ialuronico, che porta al suo catabolismo nei macrofagi; nonché l'assemblaggio di matrici pericellulari da proteoglicani e acido ialuronico. Due ruoli significativi per il CD44 nella pelle sono stati proposti da Kaya et al. Il primo è regolare la proliferazione dei cheratinociti in risposta a stimoli extracellulari, mentre il secondo è mantenere l’omeostasi locale dell’acido ialuronico.

ICAM-1 è noto principalmente come recettore metabolico della superficie cellulare per l'acido ialuronico e questa proteina può essere la principale responsabile del rilascio di acido dalla linfa e dal plasma sanguigno, che rappresenta la maggior parte del metabolismo dell'intero corpo. Il legame del ligando di questo recettore innesca quindi una cascata di eventi altamente coordinata che include la formazione di una vescicola endocitica, la sua fusione con i lisosomi primari, la degradazione enzimatica in monosaccaridi, il trasporto transmembrana attivo di questi zuccheri nella linfa cellulare, la fosforilazione di GlcNAc e la deacetilazione enzimatica. . Come il suo nome, ICAM-1 può anche fungere da molecola di adesione cellulare e il legame dell'acido ialuronico a ICAM-1 può aiutare a controllare l'attivazione infiammatoria mediata da ICAM-1.

Decomposizione dell'acido ialuronico

L’acido ialuronico viene scomposto da una famiglia di enzimi chiamati “ialuronidasi”. Gli esseri umani hanno almeno sette tipi di enzimi simili alla ialuronidasi, alcuni dei quali sono soppressori del tumore. I prodotti di degradazione dell'acido ialuronico, degli oligosaccaridi e dello ialuronato a peso molecolare estremamente basso presentano proprietà proangiogeniche. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che frammenti di acido ialuronico, e non quello nativo ad alto peso molecolare, sono in grado di provocare reazioni infiammatorie nelle cellule dendritiche e nei macrofagi durante il danno tissutale e il rigetto del trapianto di pelle.

Il ruolo dell'acido ialuronico nel processo di rigenerazione della ferita

La pelle funge da barriera meccanica verso l'ambiente esterno e agisce per impedire la penetrazione di agenti infettivi. Una volta danneggiati, i tessuti sottostanti sono suscettibili alle infezioni; pertanto, una guarigione rapida ed efficace è fondamentale per ripristinare la funzione di barriera. La guarigione delle ferite cutanee è un processo molto complesso e coinvolge molti processi interagenti avviati dall'emostasi e dal rilascio di fattori piastrinici. Le fasi successive sono l'infiammazione, la formazione del tessuto di granulazione, la riepitelizzazione e il rimodellamento. L’acido ialuronico probabilmente svolge un ruolo multiforme nel mediare questi eventi cellulari e della matrice. I presunti ruoli dell’acido ialuronico in questa sequenza di eventi di guarigione delle ferite cutanee sono evidenziati più dettagliatamente di seguito.

Infiammazione

Durante l'infiammazione si formano molti fattori biologici, come fattori di crescita, citochine, eicosanoidi, ecc. Questi fattori sono essenziali per le fasi successive della guarigione della ferita grazie al loro ruolo nel promuovere la migrazione delle cellule infiammatorie, dei fibroblasti e delle cellule endoteliali nel sito della ferita.

Il tessuto della ferita all'inizio della fase infiammatoria della guarigione della ferita è abbondante di acido ialuronico, che è probabilmente il riflesso di una maggiore sintesi. L’acido ialuronico agisce come promotore dell’infiammazione precoce, che è fondamentale per il processo generale di guarigione delle ferite della pelle. In un modello murino di sacca d’aria di infiammazione indotta da carragenina/IL-1, è stato osservato che l’acido ialuronico migliora l’infiltrazione cellulare. Kobayashi et al hanno mostrato un aumento dose-dipendente della produzione di citochine proinfiammatorie TNF-α e IL-8 da parte di fibroblasti uterini umani a concentrazioni di acido ialuronico comprese tra 10 μg/ml e 1 mg/ml attraverso un meccanismo mediato da CD44. Le cellule endoteliali, in risposta alle citochine infiammatorie come il TNF-α e il lipopolisaccaride batterico, sintetizzano anche l'acido ialuronico, che ha dimostrato di migliorare l'adesione primaria dei linfociti attivati ​​da citochine che esprimono varianti CD44 leganti HA in condizioni di flusso laminare e statico. È interessante notare che l’acido ialuronico ha duplici funzioni contrastanti nel processo infiammatorio. Non solo può favorire l’infiammazione, come affermato sopra, ma può anche moderare la risposta infiammatoria, contribuendo a stabilizzare la matrice del tessuto di granulazione, come descritto nella parte successiva.

Granulazione e organizzazione della matrice tissutale di granulazione

Il tessuto di granulazione è un tessuto connettivo fibroso ben perfuso che sostituisce i coaguli di fibrina nelle ferite in via di guarigione. Di solito cresce dalla base della ferita e può riempire ferite di quasi tutte le dimensioni. L'acido ialuronico si trova in abbondanza nella matrice del tessuto di granulazione. A questa rete ricca di acido ialuronico possono essere attribuite molte diverse funzioni cellulari essenziali per la riparazione dei tessuti. Queste funzioni includono il miglioramento della migrazione cellulare nella matrice pre-ferita, la proliferazione cellulare e l'organizzazione della matrice del tessuto di granulazione. Naturalmente, l’inizio dell’infiammazione è estremamente importante per la formazione del tessuto di granulazione, quindi il ruolo proinfiammatorio dell’acido ialuronico, come discusso sopra, contribuisce anche a questa fase di guarigione della ferita.

Acido ialuronico e migrazione cellulare

La migrazione cellulare è essenziale per la formazione del tessuto di granulazione. La fase iniziale del tessuto di granulazione è dominata da una matrice extracellulare ricca di acido ialuronico, che è considerato un ambiente favorevole per la migrazione cellulare nella matrice della ferita temporanea. La promozione della migrazione cellulare da parte dell'acido ialuronico può essere attribuita alle sue proprietà fisico-chimiche, come indicato sopra, nonché alla sua interazione diretta con le cellule. Nel primo scenario, l’acido ialuronico è una matrice idratata aperta che migliora la migrazione cellulare, mentre nel secondo scenario, la migrazione controllata e il controllo dei meccanismi locomotori cellulari sono mediati attraverso specifiche interazioni cellulari tra l’acido ialuronico e i recettori HA della superficie cellulare.

Come affermato in precedenza, i tre principali recettori della superficie cellulare per l’acido ialuronico sono CD44, RHAMM e ICAM-1. RHAMM è più correlato alla migrazione cellulare. Forma connessioni con diverse proteine ​​chinasi associate alla locomozione cellulare, come la proteina chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK), p125fak e pp60c-src. Durante lo sviluppo fetale, le vie migratorie attraverso le quali migrano le cellule della cresta neurale sono ricche di acido ialuronico. L’acido ialuronico è strettamente associato al processo di migrazione cellulare nella matrice del tessuto di granulazione e la ricerca suggerisce che il movimento cellulare può essere inibito, almeno in parte, dalla degradazione dell’acido ialuronico o dal blocco dell’occupazione dei recettori HA.

Fornendo alla cellula forza dinamica, è stato dimostrato che la sintesi cellulare ialuronica è associata alla migrazione cellulare. Fondamentalmente l'acido viene sintetizzato sulle membrane plasmatiche e rilasciato direttamente nell'ambiente extracellulare. Ciò può promuovere un microambiente idratato nei siti di sintesi ed è importante per la migrazione cellulare poiché promuove la separazione cellulare.

Il ruolo dell'acido ialuronico nella gestione della risposta infiammatoria

Sebbene l’infiammazione sia parte integrante della formazione del tessuto di granulazione, affinché la normale riparazione dei tessuti possa procedere, l’infiammazione deve essere controllata. Nel tessuto di granulazione inizialmente formato, il processo infiammatorio è molto intenso con un alto tasso di metabolismo tissutale mediato da enzimi che degradano la matrice e metaboliti reattivi dell'ossigeno, che sono prodotti delle cellule infiammatorie.

La stabilizzazione della matrice del tessuto di granulazione può essere ottenuta moderando l'infiammazione. L'acido ialuronico funziona come un importante moderatore in questo processo, il che è contrario al suo ruolo nella stimolazione infiammatoria come descritto sopra. L'acido ialuronico può proteggere dagli effetti dannosi dei radicali liberi sulle cellule. Ciò è dovuto alla proprietà di eliminazione dei radicali liberi, una proprietà fisico-chimica condivisa dai grandi polimeri poliionici. In un modello di ratto con proprietà di eliminazione dei radicali liberi studiato da Foshee e colleghi, è stato dimostrato che l'acido ialuronico riduce il danno al tessuto di granulazione.

Oltre al suo ruolo di eliminazione dei radicali liberi, l’acido ialuronico può anche funzionare nel circuito di feedback negativo dell’attivazione infiammatoria attraverso le sue specifiche interazioni biologiche con i componenti biologici dell’infiammazione. Il TNF-α, un'importante citochina prodotta durante l'infiammazione, stimola l'espressione di TSG-6 (gene 6 stimolato dal TNF) nei fibroblasti e nelle cellule infiammatorie. TSG-6, una proteina legante GC, forma anche un complesso stabile con l'inibitore della proteinasi sierica IαI (inibitore dell'Inter-α) con un effetto sinergico sull'attività inibitoria della plasmina di quest'ultimo. La plasmina è coinvolta nell'attivazione della cascata proteolitica delle metalloproteinasi della matrice e di altre proteinasi che portano al danno infiammatorio dei tessuti.

Pertanto, le azioni del complesso TSG-6/IαI, che può essere ulteriormente orchestrato legandosi all’acido ialuronico nella matrice extracellulare, possono fungere da potente circuito di feedback negativo per mitigare l’infiammazione e stabilizzare il tessuto di granulazione man mano che la guarigione procede. In un modello murino di sacca d'aria di infiammazione indotta da carragenina/IL-1 (interleuchina-1β), dove è stato dimostrato che l'acido ialuronico ha proprietà proinfiammatorie, la riduzione dell'infiammazione può essere ottenuta mediante la somministrazione di TSG-6 e il risultato è paragonabile al trattamento sistemico con desametasone.

Riepitelizzazione

L'acido ialuronico svolge un ruolo importante nella normale epidermide. L'acido ialuronico svolge importanti funzioni anche nel processo di riepitelizzazione grazie alle sue molteplici proprietà. Serve come parte integrante della matrice extracellulare dei cheratinociti basali, che sono i principali costituenti dell'epidermide, della sua funzione di eliminazione dei radicali liberi e del suo ruolo nella proliferazione e migrazione dei cheratinociti.

Nella pelle normale, l'acido ialuronico si trova in concentrazioni relativamente elevate nello strato basale dell'epidermide, dove si trovano i cheratinociti proliferanti. CD44 cocola con l'acido ialuronico nello strato basale dell'epidermide, dove è stato inoltre dimostrato che è espresso prevalentemente sulle membrane plasmatiche rivolte verso sacche di matrice ricca di acido. Mantenere lo spazio extracellulare e fornire una struttura aperta e idratata per il passaggio dei nutrienti sono le principali funzioni dell'acido ialuronico nell'epidermide.

Tammy R. e i suoi colleghi hanno riscontrato un aumento dell'acido ialuronico in presenza di acido retinoico (vitamina A). Gli effetti putativi dell’acido retinoico contro i danni della luce e l’invecchiamento cutaneo possono essere correlati, almeno in parte, con un aumento dell’acido ialuronico nella pelle, che porta ad una maggiore idratazione dei tessuti. È stato suggerito che le proprietà di eliminazione dei radicali liberi dell’acido ialuronico contribuiscano alla protezione solare supportando il ruolo del CD44 come recettori HA nell’epidermide.

L'acido ialuronico epidermico funziona anche come manipolatore nel processo di proliferazione dei cheratinociti, estremamente importante per il normale funzionamento dell'epidermide, nonché durante la riepitelizzazione nella riparazione dei tessuti. Durante la guarigione della ferita, l'acido ialuronico viene espresso sul bordo della ferita, nella matrice del tessuto connettivo, ed è allineato con l'espressione del CD44 nella migrazione dei cheratinociti.

Kaya e colleghi hanno scoperto che la soppressione dell'espressione di CD44 da parte di un transgene antisensoriale specifico dell'epidermide determinava l'accumulo di acido ialuronico difettoso nel derma superficiale negli animali, accompagnato da vari cambiamenti morfologici nei cheratinociti basali e da una proliferazione difettosa dei cheratinociti in risposta al mitogeno e ai fattori di crescita . Sono stati inoltre osservati una ridotta elasticità della pelle, una ridotta risposta infiammatoria locale e una ridotta rigenerazione dei tessuti. Le loro osservazioni supportano fortemente gli importanti ruoli dell’acido ialuronico e del CD44 nella fisiologia della pelle e nella rigenerazione dei tessuti.

Guarigione delle ferite e cicatrici nel feto

L’assenza di cicatrici fibrose è una caratteristica importante della guarigione delle ferite fetali. Anche a lungo termine, il contenuto di acido ialuronico nelle ferite fetali è ancora più elevato che nelle ferite degli adulti, suggerendo che l’acido può, almeno parzialmente, ridurre la deposizione di collagene, che di conseguenza porta a una riduzione delle cicatrici. Questa proposta è coerente con uno studio di West e colleghi, che ha dimostrato che nella guarigione delle ferite dell'adulto e del feto alla fine della gravidanza, la rimozione dell'acido ialuronico porta a cicatrici fibrotiche.

Video sull'acido ialuronico

Ruolo nelle metastasi del cancro

Le sintasi dell'acido ialuronico (HAS) svolgono un ruolo in tutte le fasi delle metastasi del cancro. Producendo l'acido ialuronico antiadesivo, SHA può consentire alle cellule tumorali di liberarsi dalla maggior parte del tumore e, se l'acido si lega a recettori come CD44, l'attivazione delle Rho GTPasi può promuovere la transizione epiteliale-mesenchimale delle cellule tumorali. Durante il processo di intravaso o stravaso, l'interazione dell'acido ialuronico rilasciato da SHA con recettori come CD44 o RHAMM migliora i cambiamenti nelle cellule che consentono alle cellule tumorali di entrare nei sistemi vascolare o linfatico. Mentre viaggia in questi sistemi, l’acido ialuronico rilasciato da SHA protegge le cellule tumorali dai danni fisici. Infine, nella formazione di una lesione metastatica, l’SGC produce acido ialuronico per consentire alle cellule tumorali di interagire con le cellule native nel sito secondario e produrre da sole un tumore.

Anche le ialuronidasi (GCases o HYAL) svolgono molteplici ruoli nelle metastasi del cancro. Aiutando a scomporre la matrice extracellulare che circonda il tumore, le ialuronidasi aiutano le cellule tumorali a separarsi dalla massa tumorale primaria e svolgono un ruolo importante nell’intravasazione promuovendo la rottura della membrana basale dei vasi linfatici o sanguigni. Le ialuronidasi svolgono nuovamente questi ruoli nel sostenere la formazione metastatica favorendo lo stravaso e la rimozione della matrice extracellulare dal sito secondario. Infine, le ialuronidasi svolgono un ruolo chiave nel processo di angiogenesi. I frammenti di acido ialuronico migliorano l’angiogenesi e le ialuronidasi producono questi frammenti. È interessante notare che l’ipossia aumenta anche la produzione di acido ialuronico e l’attività delle ialuronidasi.

I recettori dell’acido ialuronico, CD44 e RHAMM, sono i più studiati per il loro ruolo nelle metastasi del cancro. L'aumento dell'espressione clinica di CD44 era correlato positivamente con le metastasi in numerosi tipi di tumore. Meccanicamente, CD44 influenza l'adesione delle cellule tumorali tra loro e alle cellule endoteliali, riorganizza il citoscheletro attraverso Rho GTPasi e migliora l'attività degli enzimi che degradano la matrice extracellulare. L'aumento dell'espressione di RHAMM è stato anche clinicamente correlato alle metastasi del cancro. Meccanicamente, RHAMM promuove la motilità delle cellule tumorali attraverso una serie di percorsi, tra cui la chinasi di adesione focale (FAK), la MAP chinasi (MAPK), PP60 (c-src) e la Rho chinasi target a valle (ROK). RHAMM può anche cooperare con CD44 per promuovere l'angiogenesi verso la formazione metastatica.

Uso dell'acido ialuronico in medicina

L'acido ialuronico si trova in molti tessuti del corpo, come la pelle, la cartilagine e il corpo vitreo. Pertanto, è adatto per applicazioni biomediche mirate a questi tessuti. Il primo prodotto biomedico ialuronico, Healon, è stato sviluppato negli anni '70 e '80 da Pharmacia ed era destinato all'uso nella chirurgia oculare (ad esempio, trapianti di cornea, chirurgia della cataratta, chirurgia del glaucoma e chirurgia del distacco della cornea). Anche altre aziende biomediche producono marchi di acido ialuronico per la chirurgia oculare.

L'acido ialuronico nativo ha un'emivita relativamente breve, quindi sono stati utilizzati vari metodi di produzione per aumentare la lunghezza della catena e stabilizzare la molecola per uso medico. L'introduzione di legami incrociati a base proteica, l'introduzione di molecole che eliminano i radicali liberi come il sorbitolo e la stabilizzazione minima delle catene di acido ialuronico utilizzando sostanze chimiche come la stabilizzazione NASHA sono tutti metodi che sono stati utilizzati.

Alla fine degli anni ’70, l’impianto di lenti intraoculari era spesso accompagnato da un grave edema corneale dovuto al danno alle cellule endoteliali durante l’intervento chirurgico. Era evidente che per prevenire tale raschiamento delle cellule endoteliali era necessario un lubrificante viscoso, trasparente e fisiologico. Endre Balazs brevettò all'inizio degli anni '70 un metodo per estrarre l'acido ialuronico, un lubrificante fisiologico (che chiamò "Healon") dalle creste dei galli.

Innanzitutto, Balazs considerava Healon un sostituto vitreo non infiammatorio. Klaus Dollman ha utilizzato Healon di Balazs in un caso in cui si è verificato un appiattimento della camera anteriore dopo un complesso trapianto di cornea. Sebbene si possa immaginare che l’acido ialuronico viscoso possa portare ad un aumento della pressione intraoculare, Dolman non ha riportato tale aumento. Da allora, Balazs ha concesso in licenza il processo di sintesi a Pharmacia, un'azienda farmaceutica svedese.

L'invenzione riguarda l'industria farmaceutica e di lavorazione del pollame, ovvero un metodo biochimico per la produzione di acido ialuronico, utilizzato in medicina come cicatrizzante e prolungatore dell'azione di vari farmaci, in profumeria e cosmetica. Nel metodo per la produzione di acido ialuronico, compresa la macinazione delle creste di gallo, l'estrazione, la combinazione degli estratti, la separazione della fase acquosa, la deposizione del prodotto desiderato, prima della macinazione le materie prime vengono prima dissanguate con alcol etilico in un rapporto di 1: 2, quindi frantumate le materie prime vengono inoltre sottoposte a trattamento ad ultrasuoni con una frequenza di vibrazione di 16 - 20 kHz per 5 - 10 minuti, e l'estrazione viene effettuata con acqua ad una temperatura di 45 - 50 o C per 20 - 25 minuti, mentre la separazione del la fase acquosa viene effettuata mediante filtrazione sotto vuoto, precipitazione - alcool etilico al 95% in un rapporto di 1: 3, seguita da filtrazione ed essiccazione del preparato. Il metodo consente di semplificare il processo tecnologico di produzione dell'acido ialuronico. 4 illustrazioni, 2 tavole.

L'invenzione riguarda l'industria farmaceutica e di lavorazione del pollame, in particolare l'uso razionale delle materie prime e lo sviluppo di tecnologie non tradizionali basate su un metodo biochimico per la produzione di acido ialuronico (HA), utilizzato in medicina come agente di guarigione delle ferite e prolungatore dell'azione di vari farmaci, in profumeria e cosmetica. Il più vicino nell'essenza tecnica e nell'effetto ottenuto è un metodo per produrre acido ialuronico, che prevede l'estrazione ripetuta di pettini di pollo frantumati con una soluzione acquosa di alcol n-propilico, iso-propilico o terz-butilico, combinando gli estratti, aggiungendo cloruro di sodio a loro, stratificando il sistema, separando da essa la fase acquosa e la precipitazione del prodotto desiderato. Il grado di estrazione dell'acido ialuronico è del 50%, il contenuto proteico è inferiore all'1)%. Gli svantaggi di questo metodo sono la durata del processo di estrazione, il consumo significativo di solvente organico, la tossicità della produzione e l'uso limitato. L'obiettivo tecnico dell'invenzione è semplificare il processo tecnologico, ridurre la durata dell'estrazione, ridurre il livello di tossicità, l'uso limitato di solventi organici, la sua completa rigenerazione, aumentare l'efficienza economica della produzione, la capacità di collocare questa produzione nel pollame impianti di lavorazione, risolvendo il problema dell'uso razionale delle materie prime. L'obiettivo è raggiunto dal fatto che nel metodo di produzione dell'acido ialuronico, compresa la macinazione delle creste di gallo, l'estrazione, la combinazione degli estratti, la separazione della fase acquosa, la deposizione del prodotto desiderato, la novità è che prima della macinazione la materia prima viene prima dissanguata con alcool etilico in rapporto 1:2, quindi frantumate le materie prime vengono inoltre sottoposte a trattamento ad ultrasuoni con una frequenza di vibrazione di 16-20 kHz per 5-10 minuti e l'estrazione viene effettuata con acqua ad una temperatura di 45-50 o C per 20-25 minuti, mentre la separazione della fase acquosa viene effettuata mediante filtrazione sotto vuoto, precipitazione al 95% con alcool etilico in rapporto 1:3, seguita da filtrazione ed essiccamento del preparato. Il risultato tecnico si esprime non solo nel raggiungimento del compito prefissato, ma anche nell'aumento del grado di estrazione dell'acido ialuronico, nel miglioramento della qualità del prodotto target, nell'aumento della compatibilità ambientale della produzione, nello sviluppo e nell'implementazione di una tecnologia complessa che consente il utilizzo del resto del tessuto animale dal rilascio di acido nella produzione di farina per mangimi. L'acido ialuronico è un tipico mucopolisaccaride. Una sua importante caratteristica strutturale è la presenza di residui alternati di aminozuccheri e residui di acidi uronici. Nei tessuti e nei liquidi, l'HAA esiste allo stato libero o è associato a proteine, formando soluzioni viscose. Il biopolimero è compreso fino al 5% in peso nella composizione della sostanza principale di molti tipi di tessuto connettivo (creste di gallo, corpo vitreo dell'occhio, liquido sinoviale, pelle). Nei tessuti della cresta del gallo l'HAA è distribuito nelle fibre mucoidi dello strato sottocutaneo, che è più largo alla base. L'acido ialuronico è una sostanza bianca, solida, amorfa, solubile in acqua e insolubile nei solventi organici. La sua proprietà caratteristica è l'elevata viscosità. Il peso molecolare varia da 510 4 a 810 6, che dipende dall'origine del farmaco, dal metodo e dal metodo di determinazione. In termini di conformazione, le molecole HAA sono palline piegate in modo casuale. L'utilizzo dell'idrolisi acida, della metilazione, dell'utilizzo di diversi tipi di idrolisi enzimatica con ialuronidasi di varia origine e di numerosi altri metodi hanno permesso di proporre una formula per l'acido ialuronico in cui si alternano acido glucuronico e residui di N-acetilglucosamina. Questi frammenti disaccaridi sono collegati nelle molecole di acido ialuronico tramite legami 1,4 (Fig. 1). Il significato biologico dell'acido ialuronico risiede principalmente nel fatto che si tratta di una sostanza cementante, come se incollasse, per i sistemi di tessuto connettivo del corpo. È la base per il funzionamento del sistema mucolitico, che determina, in particolare, la permeabilità dei tessuti e dei vasi sanguigni. A causa dell'elevato peso molecolare, l'acido agisce come un formatore di struttura, un “legante” dell'acqua nelle cavità intermedie, matrici gelatinose, che determina il turgore dei tessuti e ne aumenta la resistenza ai carichi di compressione. Promuove la resistenza del corpo alle infezioni. Le proprietà antifrizione e smorzanti dei fluidi tissutali, in particolare del liquido sinoviale, sono determinate dalla presenza in essi di un biopolimero. Le proprietà biologiche dell'acido ne hanno determinato l'uso diffuso nella produzione di medicinali, prodotti farmaceutici e cosmetici. Ad esempio, è stata dimostrata la fattibilità dell’utilizzo dell’HCA come sostituto del corpo vitreo. L'uso delle sue soluzioni come ambiente operativo che protegge i tessuti interni dell'occhio dalle influenze meccaniche aumenta notevolmente l'efficienza delle operazioni sull'occhio umano. I materiali viscoelastici vengono creati a base di acido ialuronico. Oltre all'oftalmologia, l'acido viene utilizzato in reumatologia (per sostituire il liquido sinoviale), nel trattamento dell'artrosi, nell'artroplastica e nell'osteomia per proteggere le superfici cartilaginee e il nervo periferico, in dermatologia - per proteggere le ferite cutanee nell'eczema e nei disturbi trofici della pelle; nella produzione di cosmetici (gel, creme, lozioni). Nel determinare la composizione chimica generale delle materie prime contenenti collagene, sono stati utilizzati i seguenti metodi: frazione di massa dell'umidità -; grasso - metodo Soxhlet; scoiattolo - . La composizione frazionaria delle proteine ​​è stata determinata mediante estrazione sequenziale delle frazioni proteiche solubili in acqua, sale e alcali, rispettivamente, con acqua distillata, una soluzione di cloruro di potassio con una frazione in massa del 5% e una soluzione di idrossido di sodio con una massa frazione del 10%, seguita da determinazione quantitativa della proteina con reagente biureto. Tradizionalmente, i cordoni ombelicali, il liquido sinoviale e il corpo vitreo dell'occhio vengono utilizzati come oggetti per la produzione di acido ialuronico. questa materia prima è più accessibile agli specialisti che lavorano nel campo della medicina e della farmacologia. Anche le creste di gallo sono consigliate come fonte di HAA. La nostra analisi comparativa della composizione chimica del pettine rispetto ad altri prodotti di macellazione di pollame contenenti collagene (Fig. 2) ha mostrato la predominanza della frazione proteica in esso contenuta (19,8% in peso della materia prima) con la prevalenza di massa della frazione proteica (14,4% in peso della materia prima). L'esecuzione di una specifica colorazione istomorfologica del tessuto con il metodo di Van Gieson ha permesso di identificare un sistema densamente addensato di fibre e fasci di collagene che determinano la struttura rinforzata della cresta. Un'elevata percentuale di fibre di collagene nella struttura del tessuto con una bassa frazione di massa di grasso conferma la fattibilità di ottenere il biopolimero di interesse. Allo stesso tempo, va sottolineato che le teste di pollame dotate di cresta trovano un uso molto limitato a fini alimentari, e il solo pettine non viene affatto utilizzato come materia prima. La sua resa è del 3,8% in peso carcassa. Pertanto, l’industria della lavorazione del pollame dispone di riserve reali e sufficienti per ottenere biopolimeri aumentando la quota di utilizzo vantaggioso dei prodotti trasformati secondari di basso valore. Condizione necessaria per la produzione dell'acido ialuronico è innanzitutto la possibilità di isolarlo nel suo stato nativo altamente polimerizzato, sotto forma di preparati altamente purificati e privi di proteine. Il metodo per ottenere l'acido ialuronico è il seguente. Le creste di gallo fresche sono state sottoposte a pretrattamento sotto forma di lavaggio con acqua corrente e dissanguamento con alcool etilico in rapporto 1: 2. Lavati dal sangue, per evitare la distruzione ossidativa, i tessuti possono essere “preservati” a lungo tempo (fino a 24 mesi) ad una temperatura di 4-22 o C in etanolo al 95%. Per l'ulteriore lavorazione, i pettini sono stati frantumati utilizzando un omogeneizzatore (disintegratore, mulino a sfere). Per separare la proteina e liberare l'acido dai suoi complessi con proteine ​​ed altri mucopolisaccaridi, i favi preparati sono stati sottoposti a trattamento ultrasonico con frequenza di vibrazione di 16-20 kHz per 5-10 minuti e quindi ad estrazione acquosa alla temperatura di 45 -50°C per 20-25 minuti. La soluzione acquosa di HAA è stata separata dal residuo di tessuto mediante filtrazione sotto vuoto. Dalle soluzioni filtrate l'HAA è stato precipitato con alcool etilico al 95% in rapporto 1: 3 e filtrato. Il precipitato è stato evaporato su pentossido di fosforo sotto vuoto. Inoltre, a seconda dello scopo, il GUK viene conservato in forma essiccata a una temperatura non superiore a -18 o C o disciolto in una soluzione tampone fisiologica e confezionato in comodi contenitori, ad esempio siringhe. Il prodotto biologico così ottenuto è un plesso di fili molto sottili e di grande rigidità. È facilmente solubile in acqua, dando soluzioni completamente limpide e non opalescenti. Le materie prime sono state lavate con acqua corrente per rimuovere le impurità meccaniche dalla superficie dei colmi. Il sanguinamento è stato effettuato con alcool etilico in rapporto 1:2, che contribuisce a migliorare il colore e il grado di purificazione del biopolimero finito. L'uso di più di 2 volumi porta ad un consumo ingiustificato di alcol, che non è economicamente fattibile, e meno non dà l'effetto desiderato. Qualsiasi procedura per isolare gli HCA comporta la distruzione sequenziale delle strutture a ciascun livello di localizzazione con l'uso mirato di determinati fattori. La distruzione delle strutture a livello tissutale viene ottenuta mediante macinazione e omogeneizzazione per garantire, innanzitutto, il massimo contatto con gli estraenti. Questo contatto è potenziato dal pretrattamento con ultrasuoni del tessuto del pettine di pollame frantumato, effettuato con l'obiettivo non solo di massimizzare l'estrazione del biopolimero, ma anche di purificarlo dalle proteine ​​e da altre impurità. Si noti che la durata razionale del trattamento è di 5-10 minuti. Con un tempo di lavorazione più breve l'effetto di separazione dalla proteina è insufficiente (grado di estrazione insignificante). Tempi di lavorazione superiori a 10 minuti portano alla profonda distruzione delle fibre di collagene e ad elevate perdite della frazione di collagene, che portano anche all'impossibilità di una completa purificazione dalle impurità proteiche, il che incide sulla qualità del prodotto finito. Uno studio sull'effetto della frequenza di vibrazione del pretrattamento a ultrasuoni sull'efficienza della pulizia dei biopolimeri mostra che l'effetto migliore si ottiene nell'intervallo 16-20 kHz. Una frequenza inferiore a 16 kHz non è sufficiente per una distruzione profonda e completa dei tessuti e quindi riduce la resa del prodotto finito, mentre superiore a 20 kHz rende difficile la pulizia e riduce la qualità del farmaco. Durante il processo di estrazione acquosa, la temperatura ha un effetto significativo sulla resa di acido ialuronico (Fig. 3). Si nota che quando la temperatura raggiunge i 50 o C si osserva la massima resa del biopolimero, e un ulteriore aumento della temperatura non porta a cambiamenti significativi e crea le condizioni per lo sviluppo di processi di denaturazione e coagulazione che riducono la purezza e la qualità del farmaco. E temperature inferiori a 50 o C riducono la velocità di estrazione e, quindi, allungano l'intero ciclo tecnologico. L'acido ialuronico viene estratto da un mezzo acquoso mediante precipitazione con alcol etilico al 95%. I risultati degli studi (Fig. 4) mostrano che la resa massima del farmaco si osserva quando il rapporto tra soluzione acquosa e alcool è 1:3. Un'ulteriore aggiunta del volume di alcol è impraticabile e volumi inferiori a quelli indicati non determinano la completa precipitazione e, di conseguenza, la resa del prodotto. L'uso dell'alcol nella tecnologia di produzione dell'acido ialuronico implica la sua completa rigenerazione. Secondo la valutazione della composizione chimica, è consigliabile utilizzare il sedimento dei tessuti non disciolti (frazione di massa di proteine ​​- 14,6%; grasso - 5,6%) nella produzione di farina per mangimi. Il metodo per ottenere l'acido ialuronico è illustrato con esempi specifici. Esempio 1. Le creste di gallo fresche vengono prelavate con acqua corrente e dissanguate con alcool etilico in rapporto 1:2. A 100 g di pettini frantumati su un omogeneizzatore in rapporto 1:3 viene aggiunta acqua e posti nel contenitore di un generatore di vibrazioni ad ultrasuoni e trattati per 5 minuti ad una frequenza di vibrazione di 16 kHz. La miscela viene quindi sottoposta ad estrazione acquosa a 45°C per 20 minuti. L'estratto viene separato dalle creste mediante filtrazione sotto vuoto. L'acido ialuronico viene isolato dal mezzo acquoso mediante precipitazione con alcol etilico al 95% in rapporto 1:3. Il precipitato filtrato viene evaporato su anidride fosforica sotto vuoto. L'acido ialuronico viene conservato in forma essiccata ad una temperatura di -18 o C. I dati per gli esempi 1-4 sono presentati nella Tabella 1. Come si può vedere dai dati nella Tabella 1, il metodo di produzione dell'acido ialuronico secondo i regimi indicati negli esempi 2, 16-20 porta alla produzione di un prodotto biologico inferiore al prototipo in termini di indicatori di qualità e quindi non è fattibile dal punto di vista tecnologico. Un aumento del consumo di alcol per il sanguinamento delle materie prime e per la precipitazione acida (esempio 15, 24) non porta ad una diminuzione degli indicatori di qualità rispetto al prototipo, ma non è pratico dal punto di vista economico. Il metodo per produrre HUA secondo gli esempi 11-14, 16-23 porta ad una purificazione insufficiente del farmaco e ad una diminuzione della resa. Il metodo per produrre acido ialuronico secondo i regimi degli esempi 1, 3-10 consente di ottenere un biopolimero con elevato grado di purificazione e resa. I vantaggi della soluzione tecnica proposta rispetto al prototipo sono presentati nella Tabella 2. Il grado di estrazione dell'acido ialuronico secondo la soluzione tecnica proposta è superiore (55%) rispetto al prototipo. Ciò si traduce in costi inferiori nelle fonti di materie prime. Il metodo proposto per la produzione di acido ialuronico amplia significativamente l'ambito di applicazione della tecnologia grazie alla non tossicità della produzione. Ti consente di avvicinarlo il più vicino possibile alla fonte delle materie prime e di elaborare in modo completo le materie prime. La durata dell'estrazione è ridotta. L'efficienza economica aumenta grazie alla rigenerazione dell'alcol usato. L'uso del trattamento ad ultrasuoni aumenta la resa del farmaco, che ripaga i costi energetici nel metodo proposto. La completa esclusione dei solventi tossici garantisce il rispetto dell'ambiente della tecnologia e consente un utilizzo razionale dei residui di tessuto solido dopo l'estrazione dell'HAA direttamente a scopo alimentare. Fonti di informazione 1. 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Reclamo

Un metodo per la produzione di acido ialuronico, comprendente macinazione di creste di gallo, estrazione, combinazione di estratti, separazione della fase acquosa, deposizione del prodotto desiderato, caratterizzato dal fatto che prima della macinazione le materie prime vengono prima dissanguate con alcol etilico in un rapporto di 1: 2, quindi le materie prime frantumate vengono inoltre sottoposte a trattamento ad ultrasuoni con una frequenza di vibrazione di 16 - 20 kHz per 5 - 10 minuti e l'estrazione viene effettuata con acqua ad una temperatura di 45 - 50 o C per 20 - 25 minuti, mentre la separazione di la fase acquosa viene effettuata mediante filtrazione sotto vuoto, precipitazione - alcool etilico al 95% in rapporto 1: 3 seguita da filtrazione ed essiccamento.

Acido ialuronico– un polisaccaride naturale di origine animale. Ampiamente distribuito in natura, si trova nella sostanza fondamentale di molti tipi di tessuto connettivo e nervoso (pelle, legamenti, cordone ombelicale, valvole cardiache, corpo vitreo dell'occhio, cornea, ecc.) e di fluidi biologici (saliva, sinoviale e liquido articolare, ecc.). Nel tessuto connettivo del derma, l'acido ialuronico si trova tra le fibre di collagene ed elastina, nelle cellule dello strato corneo - nei corneociti.

Pertanto, l'acido ialuronico è uno dei componenti principali della matrice extracellulare. Partecipa in modo significativo alla proliferazione e alla migrazione cellulare. Prodotto da alcuni batteri (ad esempio, Streptococco ).

La quantità di acido ialuronico in varie fonti può arrivare fino al 5% del peso secco del tessuto. Il corpo di una persona di 70 kg contiene in media ~15 g di acido ialuronico.

Ricevuta

Nell'industria l'acido ialuronico viene prodotto in due modi: fisico-chimico e biotecnologico.

Metodo fisico-chimico. Utilizzando questo metodo, l'acido ialuronico si ottiene principalmente dalle creste del gallo, dai cordoni ombelicali umani e dagli occhi dei bovini. Lo schema tecnologico per ottenere acido ialuronico dalla suddetta biomassa prevede le seguenti fasi: digestione enzimaticatessuto connettivo con il rilascio di acido ialuronico o estrazione acido ialuronico da biomassa con soluzioni diluite di alcali o acidi, successivo frazionamento specifico del prodotto isolato per rimuovere componenti proteiche e lipidiche, diverse fasi di purificazione, precipitazione ed essiccazione.

Recentemente, l'acido ialuronico è stato prodotto sempre più in modo più economico. biotecnologicamente da materie prime vegetali (substrato di grano) utilizzando colture batteriche ( Streptococco zooepidermico O Streptococco equi). Le fasi per ottenere l'acido ialuronico mediante la biotecnologia sono le seguenti: rigorosamente controllate biosintesi acido ialuronico cellule batteriche(i batteri si moltiplicano e vengono posti in un serbatoio di fermentazione, dove sintetizzano l'acido ialuronico in condizioni speciali); isolamento dell'acido ialuronico accumulato dai batteri e sua ulteriore purificazione; precipitazione ed essiccazione. Tutti i processi di produzione biotecnologica dell'acido ialuronico vengono effettuati in condizioni di costante controllo batteriologico e reologico, garantendo l'alta qualità del prodotto risultante e, soprattutto, il peso molecolare specificato dell'acido ialuronico.

Struttura chimica e struttura molecolare

Acido ialuronico– glicosaminoglicani non solfonati. In condizioni naturali, l'acido ialuronico viene sintetizzato da una classe di proteine ​​di membrana incorporate chiamate sintetasi ialuronato. I vertebrati contengono tre tipi di ialuronato sintetasi: HAS1, HAS2 e HAS3. Si pensa che questi enzimi colleghino le molecole acido glucuronico E N -acetilglucosamina in ordine rigorosamente alternato.

La formula strutturale di un frammento della macromolecola dell'acido ialuronico è mostrata in Fig. 1. Le catene macromolecolari sono costruite da unità alternate di residui β- D -acido glucuronico E β- N -acetilglucosamina imparentato β-(1→4)- E Legami β-(1→3)-glicosidici.

Atomi di idrogeno dei gruppi COOH di alcune unità elementari β- D L'acido -glucuronico può essere sostituito da Na o K. Tali polisaccaridi sono chiamati sale sodico o potassico dell'acido ialuronico ( ialuronato di sodio O ialuronato di potassio).

L'unità elementare ripetitiva della macromolecola dell'acido ialuronico è il frammento disaccaridico. A titolo esemplificativo, in Fig. 2 è riportata l'unità elementare della macromolecola del sale sodico dell'acido ialuronico

La conformazione energeticamente più favorevole dell'unità elementare della molecola di acido ialuronico è la conformazione a sedia C1 (Fig. 3).

I sostituenti principali sull'anello piranosico si trovano in posizione stericamente favorevole equatoriale posizioni e gli atomi di idrogeno più piccoli occupano posizioni meno favorevoli assiale posizioni.

A causa della presenza di legami β-(1→3)-glicosidici, la macromolecola dell'acido ialuronico, che conta diverse migliaia di residui monosaccaridici, assume una conformazione ad elica (Fig. 4).

Ci sono tre blocchi di disaccaridi per giro dell'elica. I gruppi carbossilici idrofili dei residui di acido glucuronico situati sul lato esterno dell'elica possono legare gli ioni Ca 2+.

Viene fornito un breve profilo storico sulla scoperta e sullo studio completo degli acidi ialuronici. In termini comparativi, è stata effettuata una sistematizzazione dei dati della letteratura scientifica sulle caratteristiche della struttura chimica, proprietà fisico-chimiche, affiliazione istologica e citologica, funzioni e metabolismo degli acidi ialuronici in organismi di vari gruppi tassonomici. Sono state identificate le caratteristiche della composizione enzimatica che garantiscono la sintesi e la degradazione del biopolimero nei microrganismi e nelle cellule dei tessuti dei mammiferi. Vengono analizzate le tecnologie tradizionali per l'estrazione delle materie prime dagli animali e i metodi per la loro produzione basati su colture di Streptococcus equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemiсus e Bacillus subtilis. Lo sviluppo scientifico e tecnico di biotecnologie innovative di acidi ialuronici di vari pesi molecolari e le prospettive per la loro implementazione produttiva sono comprovati. Vengono presentate informazioni sull'uso di prodotti basati su di essi in vari ambiti della vita moderna.

acido ialuronico

tecnologie di sintesi microbica

biotecnologia

batteri

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UNA DESCRIZIONE DEI DIVERSI METODI UTILIZZATI PER OTTENERE L'ACIDO IALURONICO

1 Università statale di Penza

Astratto:

L'articolo fornisce un breve profilo storico della scoperta e dello studio completo degli acidi ialuronici. Confrontiamo e sistematizziamo articoli scientifici concentrandoci sulle caratteristiche specifiche delle funzioni, del metabolismo, della costituzione chimica, delle proprietà fisiche, chimiche, istologiche e citologiche degli acidi ialuronici in organismi appartenenti a diversi gruppi tassonomici. Riveliamo anche le caratteristiche specifiche della composizione enzimatica che assicurano la sintesi e la degradazione dei biopolimeri nei microrganismi e nelle cellule dei tessuti dei mammiferi. Inoltre, analizzeremo le tecnologie di estrazione tradizionali utilizzate con materie prime di origine animale e le modalità per ottenerle dallo Streptococcus equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemiсus e Bacillus subtilis. Inoltre, presentiamo le basi per lo sviluppo scientifico e tecnico di biotecnologie innovative legate agli acidi ialuronici a diverso peso molecolare e le loro prospettive di produzione. Infine, forniamo informazioni su come i prodotti a base di acido ialuronico vengono utilizzati nei diversi ambiti della vita moderna.

Parole chiave:

tecnologie di sintesi microbica

Negli ultimi anni, la medicina, la farmaceutica e la cosmetologia hanno fatto passi da gigante nell'uso di composti ad alto peso molecolare (HMC) come principali principi attivi, nonché di sostanze ausiliarie, correttive e riempitivi. Uno degli IUD più popolari in medicina e cosmetologia oggi è l'acido ialuronico (HA), che ha trovato la sua applicazione in chirurgia come sostituto del liquido sinoviale nelle articolazioni come componente lubrificante e condroprotettivo; dermatologia, come agente rimodellante nella correzione delle deformazioni legate all'età della pelle del viso, in particolare della pelle del contorno occhi; ginecologia, come agente antiadesione per aderenze intravaginali. Pertanto, la gamma di applicazioni dell’acido ialuronico è molto ampia; viene costantemente rifornito, il che porta ad un aumento della domanda per questo tipo di biopolimero e, di conseguenza, all'interesse per fonti alternative di produzione.

1. Storia della scoperta dell'acido ialuronico

Nel 1934, sul Journal of Biological Chemistry fu pubblicato un articolo di Karl Mayer e John Palmer, che menzionava un insolito polisaccaride isolato dal corpo vitreo dell'occhio di bue (dal greco hyalos - vetroso e dall'inglese uronic acid - acido uronico), peso molecolare piuttosto elevato 450 g/mol e privo di gruppi solfato. Ulteriori studi hanno dimostrato che il polisaccaride è rappresentato da frammenti di un disaccaride, costituito da acido D-glucuronico e glucosamina N-acetilata.

I dati sull'appartenenza del biopolimero solo alle strutture degli organismi mammiferi furono confutati quando nel 1937 Kendal e Heidelberger annunciarono l'isolamento di un polisaccaride identico allo ialuronato dal fluido di coltura dello streptococco emolitico. L'identità del biopolimero isolato è stata da loro confermata successivamente, dopo aver stabilito la struttura del polisaccaride negli anni '60. Nel 1954, sulla rivista Nature, il capo del laboratorio Meyer pubblicò la formula strutturale di un frammento disaccaride, un prodotto della scissione da parte della ialuronato liasi streptococcica.

L’interesse scientifico per l’acido ialuronico, la sua produzione, isolamento e utilizzo è sempre più crescente. Ad oggi sono stati pubblicati più di 15.000 articoli su riviste nazionali e straniere. Il risultato della ricerca è stata la ricezione di dati affidabili sull'isolamento dell'acido ialuronico da vari organi di mammiferi, nonché da colture di varie cellule (streptococco emolitico, streptomiceti, corinebatteri). Alcuni dati avevano un significato industriale, ad esempio l'estrazione dell'acido ialuronico dai pettini di pollo viene utilizzata ancora oggi. Nel corso di mezzo secolo, anche la gamma di applicazioni dell'acido ialuronico è aumentata (chirurgia, cosmetologia, traumatologia e ortopedia, dermatologia, ecc.) E sono state create le più nuove forme di dosaggio basate sulla sua struttura polimerica. Tutto ciò non è stato possibile senza stabilire il ruolo biologico del biopolimero, che, come si è scoperto, serviva come componente della matrice cellulare necessaria per la normale attuazione dei processi metabolici di proliferazione e differenziazione dei tessuti. È così che è stato studiato il processo del metabolismo dell'acido ialuronico nel corpo umano. È noto che ogni giorno vengono scomposti e sintetizzati circa 5 g di acido ialuronico e il suo contenuto nel corpo umano è di circa lo 0,007%, ovvero circa 15 g in una donna di 70 kg.

Nel 1953 Roseman, Moses e Dorfman pubblicarono lavori che indicavano un metodo per ottenere l'acido ialuronico, la sua precipitazione e l'isolamento in forma libera a partire da colture di streptococco emolitico. I loro metodi di isolamento e precipitazione furono successivamente migliorati da Zifonelli e Maedo, che aumentarono la resa e la purezza del prodotto. Il meccanismo di formazione dell'acido ialuronico nei batteri, compresi gli streptococchi, è stato rivelato successivamente quando è stata studiata la composizione enzimatica dei microrganismi in grado di sintetizzare l'acido ialuronico. Nel 1959 fu dimostrata l'esistenza di peptidi specifici della ialuronano sintetasi, che effettuano la sintesi del polisaccaride nelle membrane batteriche.

Nel 1992, gli scienziati americani annunciarono la clonazione del gene responsabile della sintesi della ialuronano sintetasi e il suo trasferimento in un ceppo di Escherichia coli. Tuttavia, non sono riusciti a ottenere un enzima attivo. DeAngelis nel 2002 ha riportato il successo dell'isolamento dell'operone ialuronato sintetasi e della sua espressione in un microrganismo. Questo è stato il primo caso di clonazione di glicosaminoglicani sintetasi nella pratica mondiale.

Attualmente, in tutto il mondo vengono condotte ricerche sui meccanismi d'azione degli acidi ialuronici, sul loro ruolo nel corpo umano e sulle modalità di utilizzo alternative. Tuttavia, le questioni relative alla sintesi microbica dell'acido ialuronico sono particolarmente rilevanti, come dimostra il prezzo per chilogrammo di prodotto purificato, che è di circa 700.000 rubli. (prodotto importato a base di materie prime animali). Pertanto, negli ultimi 20 anni, nel mondo sono stati rilasciati più di 50 brevetti, il che indica un elevato interesse per il problema in esame.

2. Struttura chimica e proprietà fisiche dell'acido ialuronico

Al laboratorio Meyer ci sono voluti circa 20 anni dalla prima pubblicazione della scoperta dell'acido ialuronico polisaccaride animale (1934) per stabilire l'esatta struttura chimica dell'acido ialuronico. L'acido ialuronico, ialuronato o ialuronato - (C14H21NO11)n è un composto organico appartenente al gruppo dei glicosaminoglicani non solfatati (Fig. 1). La presenza di numerosi gruppi solfati nei glicosaminoglicani correlati è causa di numerosi isomerismi, che non si osservano nell'acido ialuronico, che è sempre chimicamente identico, indipendentemente dalle modalità e dalle fonti di produzione. La molecola di acido ialuronico è costituita da frammenti ripetuti di acido D-glucuronico e N-acetil-D-glucosamina, collegati da un legame glicosidico β-(1-3). La struttura portante dei frammenti di zucchero è un anello di glucopiranosio con vari sostituenti (gruppo acetamidico, gruppi funzionali idrossile e carbossile).

Riso. 1. Formula chimica dell'acido ialuronico

La molecola di acido ialuronico è caratterizzata dalla formazione di un gran numero di legami idrogeno sia all'interno della molecola che tra residui di carboidrati vicini situati a notevole distanza l'uno dall'altro, e in una soluzione acquosa anche tra molecole vicine attraverso i gruppi carbossilici e acetamidici. Ha una reazione acida dovuta alla presenza di un gruppo carbossilico non protonato. Le proprietà acide dello ialuronato consentono di ottenere sali idrosolubili con metalli alcalini. L'acido ialuronico è un polisaccaride lineare anionico con peso molecolare variabile di 105-107 Da. Il peso molecolare dipende dal metodo di produzione e, grazie all'assenza di isomeria, lo ialuronato risultante è sempre chimicamente identico a quello standard.

Soluzioni di acido ialuronico all'1-4% formano pseudogel. In un ambiente acquoso, il potere di acidità del gruppo carbossilico (pK) è circa 3-4, pertanto, per mantenere la neutralità elettrica in soluzione, la molecola è circondata da cationi metallici caricati positivamente, Na+, K+, Mg2+ e Ca2+, che portano alla formazione di una forte struttura gelica con un elevato contenuto di acqua. Con metalli pesanti e coloranti forma complessi insolubili in acqua. Inoltre, lo ialuronato reagisce specificamente con le proteine ​​e, di conseguenza, ci fornisce complessi simili a gel, che spesso precipitano.

In una soluzione acquosa, l'acido ialuronico ha una dimensione longitudinale della catena polisaccaridica sufficientemente grande - circa 1 nm, quindi, essendo nel corpo dei mammiferi, l'acido ialuronico assume la forma più compatta. Attraverso l'analisi della diffrazione dei raggi X, si è scoperto che lo ialuronato può formare eliche singole e doppie sinistrorse, varie strutture piatte a più filamenti, nonché strutture superavvolte con variazioni di concentrazione in diverse parti della catena, formando una fitta rete molecolare , che costituisce la struttura secondaria del polisaccaride. Ciò è dovuto principalmente alla formazione di legami idrogeno, al legame con cationi di metalli alcalini e alle interazioni idrofobiche. La struttura terziaria dell'acido ialuronico è una rete con elevate proprietà reologiche (i domini si respingono a vicenda), in grado di assorbire quantità significative di acqua ed elettroliti, nonché grandi molecole proteiche, ma la struttura terziaria non forma una dimensione dei pori precisamente definita. Le reti hanno un ordinamento molto chiaro dovuto alla presenza di effetti elettronici da parte di gruppi funzionali e sostituenti. In questo caso la molecola assume la posizione energeticamente più favorevole, che dipende anche dall'ambiente ionico.

3. Natura dell'acido ialuronico, funzioni dello ialuronato in base all'affiliazione istologica e citologica in vari organismi

La presenza di ialuronato sintetasi e acidi ialuronici nelle capsule di virus e batteri del genere Streptococcus può essere spiegata come un adattamento evolutivo adattivo che batteri e virus hanno preso in prestito da animali superiori, aumentando così la loro capacità di superare la risposta immunitaria dell’ospite.

3.1 Acido ialuronico nei tessuti dei mammiferi

Lo ialuronato è un componente importante della matrice intercellulare di vari tessuti dei mammiferi, ma è distribuito in modo non uniforme. Ad esempio, la concentrazione massima di acido ialuronico nel corpo umano si osserva nel liquido sinoviale, nel cordone ombelicale, nel corpo vitreo dell'occhio e nella pelle.

Nella pelle, il glicosaminoglicano è contenuto nello spazio interstiziale e svolge una serie di funzioni: trattiene l'acqua, mantenendo così la naturale elasticità e il volume della pelle, così importante durante le reazioni infiammatorie; partecipa ai processi di proliferazione e differenziazione dei cheratinociti e delle cellule immunocompetenti, svolgendo così un ruolo nel mantenimento del normale processo di crescita e rigenerazione della pelle e nell'implementazione dell'immunità locale, rafforza le fibre di collagene (Fig. 2); Funge da barriera naturale che protegge dai radicali liberi, dagli agenti patogeni e dalle sostanze chimiche.

Riso. 2. L'effetto dell'acido ialuronico sulle fibre di collagene.

Con la mancanza di acido ialuronico naturale, ad esempio, con l'invecchiamento o le malattie della pelle, si sviluppano disturbi degenerativi: l'immunità locale, la capacità di guarigione delle ferite e l'elasticità della pelle si riducono, il che porta alla comparsa delle rughe. Nel tessuto cartilagineo, l'HA funziona come elemento strutturale della matrice necessario per legare e trattenere il proteoglicano del condroitin solfato per rafforzare la struttura del collagene della cartilagine. Nel liquido sinoviale, lo ialuronato fornisce lubrificazione alle parti mobili dell'articolazione, riducendo l'usura. Nelle malattie infiammatorie delle articolazioni (artrite), la quantità di acido ialuronico diminuisce, la viscosità del liquido sinoviale diminuisce, con conseguente deterioramento del movimento. L'acido ialuronico svolge anche un ruolo importante nell'embriogenesi ed è un trasmettitore di segnali per la motilità cellulare.

Pertanto, le funzioni dello ialuronato sono molto estese e, man mano che l'ambito di studio delle sue proprietà si espande ulteriormente, verranno scoperti sempre più nuovi fatti sul ruolo del glicosaminoglicano nel corpo umano e dei mammiferi.

3.2 Acido ialuronico come componente delle capsule batteriche

4. Metabolismo dell'acido ialuronico

La sintesi dell'acido ialuronico è abbastanza ben studiata. Per i mammiferi e i batteri dei generi Streptococcus e Pasteurella, la biochimica del processo non è fondamentalmente diversa. La sintesi dell'acido ialuronico richiede componenti polimerici: acido glucuronico e N-acetilglucosamina. L'acido glucuronico viene sintetizzato attraverso una serie di reazioni enzimatiche dal glucosio-6-fosfato (Figura 3).

Riso. 3. Schema di sintesi dei glicosaminoglicani

Il glucosio-6-fosfato viene isomerizzato in glucosio-1-fosfato dall'enzima α-fosfoglucomutasi. Successivamente, l'enzima UDP-glucosio pirofosforilasi catalizza la formazione di UDP-glucosio dall'uridina difosfato e dal glucosio. Successivamente, sotto l'azione dell'enzima UDP-glucosio deidrogenasi, avviene l'ossidazione enzimatica dei gruppi ossidrile del glucosio UDP. Il risultato è la formazione di acido glucuronico.

La N-acetilglucosamina è sintetizzata dal fruttosio-6-fosfato. Durante la biosintesi degli aminozuccheri, il gruppo amminico viene trasferito al fruttosio-6-fosfato. Il donatore del gruppo amminico è la glutammina, l'enzima amidotransferasi. Il risultato è la formazione di glucosamina-6-fosfato, che viene isomerizzata dalla mutasi in glucosamina-1-fosfato, che subisce acetilazione con la partecipazione dell'enzima acetiltransferasi in presenza di CoA in N-acetilglucosamina-1-fosfato, che deve essere attivato dalla pirofosforilasi in UDP-N-acetilglucosamina-1-fosfato. Questo è un processo che consuma energia.

L'ultimo passaggio nella sintesi dell'acido ialuronico è l'implementazione di una reazione della glicoside transferasi utilizzando un singolo enzima, la ialuronato sintetasi. Questo processo avviene anche con il dispendio energetico di ATP (per la sintesi di 1 mole di ialuronato vengono consumate 2 moli di ATP).

4.1. Sintetasi ialuronaniche: struttura, funzioni, localizzazione, caratteristiche cinetiche e meccanismi di catalisi

La ialuronano sintetasi è una metalloproteina da 49 kDa, un enzima che richiede cationi metallici per la coordinazione con i gruppi fosfato (attivazione) e utilizza glucoside fosfati come substrati. È l'unico enzima del suo genere che catalizza la sintesi dell'acido ialuronico nel corpo dei mammiferi e nella parete cellulare dello streptococco emolitico, nonché nel virus PBCV-1 e nel batterio Pasteurella multicida. Le ricerche effettuate negli anni '50 nel laboratorio Meyer hanno permesso di stabilire le caratteristiche dell'enzima ialuronato sintetasi: funziona a valori di pH neutri, per la catalisi necessita dell'acido glucuronico e della N-acetilglucosamina attivate per coniugazione con l'uridina difosfato, oltre che come presenza di cationi Mg2+ e Mn2+ per coordinare i gruppi fosfato. L'enzima mostra un'elevata attività in presenza di cardiopina (situata nel complesso). Il tipo 1 è stato studiato nel 1983-1998 da Prehm e Asplund, caratteristico degli streptococchi emolitici dei mammiferi: la ialuronato sintetasi sintetizza l'acido ialuronico attaccando residui di carbonio all'estremità riducente dello ialuronato, alternando legami glicosidici β (1-3) e (1-4) .

4.2. Enzimi che depolimerizzano l'acido ialuronico

Le reazioni cataboliche dell'acido ialuronico si basano sulla catalisi enzimatica attraverso gli enzimi dell'acido ialuronico. Le ialuronato liasi furono classificate nel 1971 dal laboratorio Meyer. Il concetto di questa classificazione è estremamente semplice: enzima – reazione catalizzata – prodotto della reazione. In base a questa classificazione si distinguono tre diversi tipi di ialuronidasi (ialuronato liasi):

Ialuronoglucosaminidasi (ialuronidasi dei mammiferi) - endo-β-N-acetilhexoamidinasi, scompongono l'acido ialuronico in tetra- ed esasaccaridi.

Le ialuronoglucosaminidasi non hanno specificità di substrato e sono anche in grado di formare legami incrociati tra le molecole di ialuronato e di condroitin solfato. Una delle funzioni aggiuntive delle ialuronidasi nei mammiferi è la scomposizione dello ialuronato in disaccaridi per produrre energia.

Le ialuronato liasi (ialuronidasi batteriche) sono endo-β-acetil-esoamminoeliminasi che idrolizzano lo ialuronato in disaccaridi 4,5-insaturi. Hanno un'elevata specificità del substrato. Nei batteri, le ialuronidasi sono un fattore di patogenicità necessario per l'invasione e l'adesione dei batteri (per la penetrazione nel corpo di un mammifero).

5. Ottenere acido ialuronico

Tutti i metodi noti per ottenere l'acido ialuronico possono essere suddivisi in due gruppi: il metodo fisico-chimico, che consiste nell'estrarre lo ialuronato da tessuti animali di mammiferi, altri vertebrati e uccelli; e un metodo microbico per produrre HA basato sulla produzione di batteri.

5.1. Metodo fisico-chimico: estrazione da materie prime animali

Come affermato in precedenza, l'acido ialuronico si trova in molti tessuti di mammiferi e uccelli e, a seconda dell'istologia, il contenuto di acido ialuronico e il suo peso molecolare possono variare. Inoltre, in vari tessuti, lo ialuronato può complessarsi con proteine ​​e relativi polisaccaridi, il che rende difficile la sua purificazione e il successivo isolamento. Attualmente, i cordoni ombelicali dei neonati e i pettini di pollo vengono utilizzati per la produzione industriale. Tuttavia, oltre ai metodi sopra menzionati, vengono descritti vari metodi per isolare lo ialuronato basati sul corpo vitreo degli occhi dei bovini, sul liquido sinoviale, sulle capsule articolari, sulla pelle di maiale, sul plasma sanguigno e sul tessuto cartilagineo. Quando si isola un biopolimero, vengono utilizzati vari metodi di isolamento: omogeneizzazione, estrazione, precipitazione frazionata, ecc.

Qualsiasi procedura per isolare l'acido ialuronico comporta la distruzione preliminare di organi e tessuti contenenti il ​​biopolimero e i complessi proteina-carboidrato. La distruzione si ottiene attraverso tecniche di macinazione e omogeneizzazione. L'omogenato risultante viene poi sottoposto ad estrazione utilizzando solventi organici acquosi. Le impurità peptidiche legate in modo covalente vengono rimosse mediante proteolisi enzimatica, trattamento con proteasi (papaina) o denaturazione chimica (cloroformio, alcol amilico con etanolo). La fase successiva è l'adsorbimento su carbone attivo mediante elettrodialisi. Il biopolimero viene purificato dalle impurità mucopolisaccaridiche mediante precipitazione con cloruro di cetirpiridinio o mediante cromatografia a scambio ionico.

Il metodo più utilizzato, grazie alla disponibilità di materie prime e all'alto contenuto di biopolimeri, è il metodo di isolamento dell'acido ialuronico dalle creste di gallo. L'estrazione viene effettuata con una miscela di acetone e cloroformio (rimozione delle proteine), acqua o una miscela idroalcolica (alcoli propionici, terz-butilici) seguita da assorbimento su carbone attivo, mediante elettroforesi o su resina a scambio ionico.

5.2. Sintesi microbica, produttori di acido ialuronico

Il metodo di sintesi microbica dell’acido ialuronico basato su ceppi batterici produttori è economicamente più vantaggioso. Una tale sintesi, una volta introdotta nella produzione su larga scala, avrà costi minori, come il costo delle materie prime animali e la dipendenza dalle forniture stagionali. E, al contrario, la produzione di ialuronato basato sulla sintesi microbica consentirà di aumentare la produzione e ottenere un prodotto altamente purificato che non contenga impurità e, quindi, con bassa allergenicità. Dalla scoperta della capacità dei batteri di sintetizzare l'acido ialuronico, sono state costantemente condotte ricerche sulla possibilità di ottenere il polimero desiderato con mezzi biotecnologici, cioè coltivando batteri produttori su terreni nutritivi di una determinata composizione in condizioni rigorosamente specificate con successivo isolamento di il prodotto di destinazione. I produttori di acido ialuronico includono batteri che formano capsule dei generi Streptococcus e Pasteurella. Esistono numerosi requisiti per la produzione di ceppi:

Mancanza di patogenicità e, soprattutto, attività emolitica;

Capacità di sintetizzare acido ialuronico ad alto peso molecolare;

Capsule di grandi dimensioni con un alto contenuto di biopolimeri (le capsule dovrebbero essere facili da separare, preferibilmente durante l'estrazione);

Mancanza di attività ialuronidasica per eliminare la perdita del prodotto target;

Elevata capacità di crescita, con l'utilizzo più completo del substrato;

Conservazione della stabilità delle proprietà fisiologiche e biochimiche.

La ricerca per trovare un ceppo che potesse soddisfare i requisiti del biopolimero e soddisfare tutti i parametri ha portato allo Streptococcus equi surbsp. equi. e Streptococcus equi surbsp. zooepidemiсus.

I tipi selvatici di streptococchi sintetizzano proteine ​​extracellulari, il che riduce la resa del biopolimero. Pertanto, per ottenere ceppi riproduttivi ialuronidasi negativi e non emolitici, sono stati modificati mediante mutagenesi chimica e indotta da UV o mutagenesi non diretta seguita da selezione. I ceppi geneticamente modificati di Escherichia coli ottenuti sulla base di metodi per esprimere operoni che codificano la sintesi della ialuronato sintetasi streptococcica su una matrice batterica non sono attualmente utilizzati a causa della bassa resa in biopolimero. Un'eccezione può essere considerata il ceppo geneticamente modificato di Bacillus subtilis, che mostra elevate rese di biopolimero quando cresce su terreni fermentati complessi.

Biotecnologia di sintesi microbica dell'acido ialuronico a base di ceppi di Streptococcus zooepidemicus. Di seguito è riportata la composizione tipica di un mezzo nutritivo sintetico per batteri del genere Streptococcus che sintetizzano l'acido ialuronico.

Fonte di carboidrati ed energia: glucosio - 1000; aminoacidi: DL-alanina, L-arginina, acido L-aspartico, L-cistina, L-cisteina, acido L-glutammico, L-glutammina, L-glicina, L-istidina, L-isoleucina, L-leucina, L - lisina, L-metionina, L-fenilalanina, idrossi-L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina 100 ciascuna; vitamine: biotina - 0,2, acido folico - 0,8, nicotinamide - 1, nicotinammide adenina dinucleotide - 2,5, pantotenato di calcio - 2, piridossale - 1, piridossamina cloridrato - 1, riboflavina - 2, tiamina cloridrato - 1; nucleotidi: adenina - 20, guanina cloridrato - 20, uracile - 20; sali di acidi organici e inorganici: FeS04*7H20 - 5, Fe(N03)2*9H20 - 1, K2НР04 - 200, KН2Р04 - 1000, MgS04*7H20 - 700, MnS04 - 5, CaС12*6Н20 - 10, NaC2H302*3H2O - 4500, NaHC03 - 2500, NaH2P04*H20 - 3195, Na2HP04 - 7350.

La coltivazione di batteri del genere Streptococcus per ottenere HA viene solitamente effettuata in condizioni batch. Il mezzo nutritivo viene preparato una volta sciogliendo i componenti necessari del mezzo in acqua, dopodiché il mezzo viene sterilizzato. La fonte di carbonio viene sterilizzata separatamente. Dopo la semina, l'avanzamento della fermentazione viene monitorato dal consumo di substrato, dall'aumento della concentrazione cellulare, dalla formazione del prodotto (HA), dai prodotti metabolici e dai cambiamenti del pH dell'ambiente. La concentrazione massima di HA è di circa 5 g/l. Un ulteriore aumento del contenuto di HA nel mezzo porta ad un aumento multiplo della viscosità del CL, un forte deterioramento delle caratteristiche di trasferimento di massa del processo di fermentazione e difficoltà con l'aerazione e la miscelazione. La concentrazione di HA durante la fermentazione periodica o periodica con alimentazione sul substrato raggiunge il valore specificato in 6 - 26 ore. Di norma, dopo che la cultura è entrata nella fase stazionaria, il processo è completato. Le cellule dei microrganismi vengono inattivate mediante riscaldamento a 60 - 80 °C. La biomassa viene separata mediante uno dei metodi ben noti: flocculazione, separazione, centrifugazione, filtrazione. L'HA da CL viene precipitato con solventi organici o tensioattivi cationici. La purificazione viene effettuata utilizzando metodi di ultrafiltrazione, riprecipitazione o cromatografia.

Questi metodi non sono fondamentalmente diversi dai metodi per isolare l'HA da materie prime animali descritti in precedenza. Ad esempio, un brevetto su un metodo per produrre HA descrive il seguente metodo per coltivare il ceppo produttore e isolare HA. La fermentazione è stata effettuata in un bioreattore da 3 litri (fattore di riempimento del fermentatore 0,5) in un mezzo con la composizione: 2,0% glucosio, 0,5% DE, 1,5% peptone, 0,3% KH2P04, 0,2% K2HP04, 0,011% Na2S203, 0,01% MgS04 * 7H20, 0,002% Na2S03, 0,001% CoC12, 0,001% MnCl2 e 0,5% olio di soia; Il pH del mezzo è 7,0. La sterilizzazione del terreno è stata effettuata con vapore silenzioso a 120°C per 15 minuti. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, è stato aggiunto un inoculo del ceppo di coltura di S. zooepidemicus Ferm BP-878 in una quantità di 0,1 litri. La coltivazione aerobica (flusso d'aria 0,7 l/(l*min) è durata 26 ore con controllo costante della temperatura (35 °C) e miscelazione del terreno (300 giri/min). Il pH del terreno è stato mantenuto costante a 7,0. Il 24 dopo Dopo un'ora di coltivazione in condizioni asettiche, il substrato è stato alimentato con 100 ml di soluzione glucosata al 50%. Il processo è stato completato dopo 26 ore di coltivazione.

Per isolare l'HA, sono state eseguite le seguenti procedure. Alla coltura batterica sono stati aggiunti 3,2 L di acqua distillata. Dopo accurata e prolungata miscelazione, la biomassa è stata separata mediante centrifugazione. Il surnatante è stato concentrato a 1,6 L utilizzando un apparecchio di ultrafiltrazione a fibra cava e dializzato contro acqua distillata. Alla soluzione risultante è stato aggiunto acetato di sodio fino ad una concentrazione finale dello 0,5% ed è stata effettuata la precipitazione di 5 litri di alcol etilico. Il precipitato di polisaccaride è stato separato mediante centrifugazione. La purificazione dell'HA è stata effettuata sciogliendo il precipitato risultante in acqua distillata (0,5 l) e aggiungendo una soluzione acquosa al 4% di cetilpiridinio bromuro. Il precipitato di HA legato al tensioattivo cationico è stato separato e sciolto in 40 ml di soluzione di cloruro di sodio 0,3 M. La parte non disciolta del sedimento è stata scartata. Alla soluzione sono stati aggiunti 120 ml di etanolo per far precipitare l'HA. Il precipitato è stato separato e sciolto in acqua distillata, dopo di che sono state effettuate purificazione su resina a scambio ionico e ripetute precipitazioni di alcol. La resa di ialuronato di sodio purificato da una fermentazione è stata di 7,8 g, mentre il contenuto proteico nel preparato era inferiore allo 0,05%. Il peso molecolare dell'HA era 1,005 MDa.

Altri metodi di produzione biotecnologica di HA descritti nei brevetti differiscono leggermente nella composizione dei mezzi.

Biotecnologia di sintesi microbica dell'acido ialuronico a base di ceppi batterici Bacillus subtilis. I metodi per produrre acido ialuronico includono un metodo di biosintesi di HA basato su un ceppo geneticamente modificato di Bacillus subtilis, contenente un costrutto genetico comprendente un promotore che è funzionalmente attivo nella cellula specificata, e una regione codificante costituita da una sequenza nucleotidica che codifica la ialuronano sintasi streptococcica (ha un); una sequenza che codifica Bacillus UDP-glucosio-6-deidrogenasi (tuaD) o un enzima simile di origine streptococcica (hasB), e una sequenza che codifica la UDP-glucosio pirofosforilasi batterica o streptococcica.

Il metodo prevede la coltura di una cellula ospite di Bacillus in condizioni adatte per la produzione di acido ialuronico, in cui la cellula ospite di Bacillus contiene un costrutto di acido nucleico comprendente una sequenza codificante la ialuronano sintasi operativamente collegata ad una sequenza promotrice estranea alla sequenza codificante della ialuronano sintasi; ed estrarre l'acido ialuronico dal mezzo di coltura.

6. Applicazione dell'acido ialuronico

L’acido ialuronico è una sostanza dall’ampio spettro d’azione e dalle proprietà davvero sorprendenti. Pochi anni dopo la scoperta dell'acido ialuronico, iniziò lo sviluppo di farmaci a base di glucosio aminolicano per uso esterno come mezzo per aumentare le funzioni rigenerative e barriera della pelle. Tuttavia, come è noto, una sostanza ricavata da materie prime animali richiede un'accurata purificazione dalle impurità, il che impone costi di produzione aggiuntivi e si riflette sul prezzo del prodotto finale. Infatti, l'alto costo dell'acido ialuronico ha impedito per lungo tempo l'ampliamento del campo di applicazione del biopolimero, tuttavia, il graduale aumento delle conoscenze sulle proprietà del polimero e l'introduzione di metodi biotecnologici basati sulla sintesi microbica, lo hanno reso possibile ridurre sensibilmente il costo della sostanza, spingendo lo sviluppo di diverse applicazioni in cui l'acido ialuronico viene utilizzato nei campi dell'industria medica, alimentare, farmaceutica, cosmeceutica. Sono in corso ricerche per creare farmaci e integratori alimentari a base di ialuronato con effetti antinfiammatori, immunomodulatori e prolunganti, che, forse, in futuro potranno essere utilizzati come base per il trattamento di malattie in oncologia, otorinolaringoiatria, chirurgia, endocrinologia e molte altre altri ambiti dell’attività umana.

6.1. L'acido ialuronico in medicina

L'acido ialuronico ha effetti antimicrobici e rigeneranti, pertanto, sulla base di esso, sono stati sviluppati farmaci per il trattamento efficace delle lesioni cutanee. Originariamente creato come farmaci contro le ustioni, questo gruppo è attivamente utilizzato nel trattamento dei disturbi trofici dell'epitelio cutaneo di origine post-trombotica. È stato dimostrato che l'acido ialuronico a basso peso molecolare (inferiore a 10 kDa) ha un effetto angiogenico, riducendo così la formazione di aderenze e la proliferazione del tessuto connettivo, inoltre migliora la microcircolazione e riduce gli effetti dell'infiammazione.

Lo ialuronato ha la proprietà di aumentare l'attività dell'interferone, esibendo così un pronunciato effetto antivirale. È stata dimostrata l'elevata attività dei preparati a base di acido ialuronico contro il virus dell'herpes e alcuni altri. Secondo alcune fonti, l'acido ialuronico ad alto peso molecolare prolunga l'azione di altre sostanze biologicamente attive disciolte in esso. Le sostanze medicinali, a causa dell'elevata viscosità dello ialuronato, vengono rilasciate nel tessuto per lungo tempo. Viene creato un cosiddetto deposito, dal quale il BAS si diffonde gradualmente nell’ambiente corporeo. Ciò consente di aumentare l'ampiezza terapeutica, potenziare in alcuni casi l'effetto farmacologico, ridurre gli effetti collaterali e ampliare anche le possibilità di utilizzo di altri farmaci (steroidi, antibiotici, peptidi, FANS, ecc.) in combinazione con l'acido ialuronico. Ialuronato ampiamente utilizzato in chirurgia:

1. Chirurgia oftalmica: lo ialuronato di sodio viene utilizzato come agente riparativo per interventi chirurgici sullo strato endoteliale della cornea (rimozione della cataratta).

2. Traumatologia chirurgica - durante gli interventi chirurgici con un'ampia sezione di tessuto cartilagineo e artrite complicata, viene utilizzato come agente rigenerante, lubrificante, antinfiammatorio e analgesico.

6.2. Acido ialuronico in cosmetologia

L'uso dello ialuronato e dei suoi sali in cosmetologia si basa sulla capacità dei preparati contenenti ialuronato di avere effetti antinfiammatori locali, cicatrizzanti e immunomodulatori. La capacità di trattenere l'acqua nello spazio intercellulare è alla base del meccanismo di correzione delle deformazioni cutanee legate all'età. Al momento, le iniezioni di una soluzione acquosa all'1-3% di acido ialuronico per la somministrazione intra o sottocutanea sono diventate molto popolari nella pratica cosmetologica. L'introduzione dell'acido ialuronico nell'epitelio sotto forma di gel acquoso aumenta l'elasticità e la compattezza dei tessuti, donando così alla pelle le qualità e la bellezza di un tempo. Tuttavia, lo ialuronato ad alto peso molecolare è ampiamente utilizzato nella produzione di varie creme e gel combinati per uso esterno. Questo tipo di prodotti ha lo stesso obiettivo delle iniezioni: ripristinare le proprietà reologiche della pelle, prevenendo così la formazione di rughe, acne, ecc. .

L'acido ialuronico ha proprietà che lo rendono altamente adatto all'utilizzo come filler dermico: è in grado di legare grandi quantità di acqua, è naturalmente presente nella pelle e non tende a provocare reazioni indesiderate. I filler (Fill - dall'inglese - riempire) sono filler dermici iniettabili che vengono utilizzati in cosmetologia per ridurre la profondità delle rughe, delle pieghe nasolabiali e delle pieghe agli angoli della bocca. I filler vengono utilizzati anche per aggiungere ulteriore volume al viso nella zona degli zigomi, delle guance e delle labbra. Attualmente è ampiamente utilizzato un gruppo di filler HA della famiglia Surgiderm e Juvederm Ultra A. Surgiderm e Juvederm Ultra sono monofasici omogenei gel di acido ialuronico di origine non animale. Sono uno dei materiali più flessibili per il contouring ad iniezione, ciò determina non solo la facilità del loro inserimento, ma anche la loro distribuzione uniforme nei tessuti, che consente di eliminare completamente il contouring del materiale.

Una moderna serie di preparati a base di acido ialuronico PRINCESS®. PRINCESS® Filler è un impianto di gel sterile, biodegradabile, viscoelastico, trasparente, incolore, isotonico e omogeneizzato per iniezione intradermica. L'acido ialuronico reticolato contenuto in PRINCESS® Filler è prodotto dal batterio Streptococcus equi e si presenta sotto forma di soluzione con una concentrazione di 23 mg/ml in tampone fisiologico.

Conclusione

L'acido ialuronico è un prodotto di origine animale che ha proprietà davvero sorprendenti e la più ampia gamma di applicazioni sia ora che in futuro per il suo utilizzo futuro. Pertanto, non sorprende affatto che le sue proprietà vengano studiate in tutto il mondo.

Attualmente sono in fase di studio i processi e i meccanismi d’azione dell’acido ialuronico sui tessuti corporei. Vengono avanzate ipotesi sul ruolo dello ialuronato e dei relativi glicosaminoglicani nei processi di proliferazione, differenziazione, migrazione delle cellule animali, nei processi di risposta immunitaria e di embriogenesi, e si tenta di stabilire una connessione tra il peso molecolare, il grado di purificazione e l'efficacia dei farmaci.

Il metodo fisico-chimico, a causa della sua non redditività economica, sta gradualmente lasciando il posto al metodo biotecnologico di sintesi dei biopolimeri. È stata effettuata una ricerca di produttori che soddisfacessero tutti i parametri, nonché vari tipi di test per studiare il metabolismo degli acidi ialuronici. Il risultato dello studio è stato l'identificazione di una connessione diretta tra la capacità di sintetizzare gli acidi ialuronici e la presenza di specifici enzimi ialuronato sintetasi.

Negli ultimi 20 anni, l'operone che codifica per la sintesi della ialuronano sintetasi è stato isolato nella sua forma pura e ripetutamente espresso a vari tipi di microrganismi al fine di ottenere ceppi geneticamente modificati che producono acidi ialuronici. Tuttavia, il risultato non poteva essere raggiunto per molto tempo. I ceppi geneticamente modificati producevano una forma inattiva dell'enzima, pertanto non avevano la capacità di produrre acidi ialuronici. Ma studi recenti sulla creazione di un ceppo geneticamente modificato a base del batterio Bacillus sibtilis hanno mostrato buoni risultati. I ceppi batterici sintetizzano attivamente ialuronato ad alto peso molecolare, privo di inclusioni peptidiche e legami con i relativi mucopolisaccaridi.

Tuttavia, la ricerca di ceppi produttori è attualmente in corso. Si stanno testando le possibilità di sintesi dello ialuronato da parte dei batteri del genere Streptomyces e si sta sviluppando la biotecnologia basata su di essi; Inoltre, si stanno studiando le modalità di utilizzo e introduzione dello ialuronato in tutte le sfere della società.

Collegamento bibliografico

In questa rassegna storica dedicata a acido ialuronico, abbiamo cercato di attirare l'attenzione del visitatore del sito web sulle scoperte e ricerche più importanti su cui è stato costruito tutto il lavoro successivo nel campo dello studio di questo polisaccaride unico. La selezione dei dati e delle fonti per la revisione è del tutto soggettiva.

INTRODUZIONE

Al momento non ci sono dati fondamentalmente nuovi sull'acido ialuronico, quindi abbiamo deciso di affrontare l'argomento di questo breve articolo "Acido ialuronico - storia". Con l’attuale ritmo del pensiero scientifico, non tutti hanno abbastanza tempo per guardare indietro e rivedere la letteratura che descrive le scoperte chiave nel campo. acido ialuronico Abbiamo quindi cercato di riassumere brevemente i risultati esistenti. La selezione delle fonti e dei dati si basa solo sulle nostre conoscenze e opinioni e può differire dalle opinioni di altri.

COME TUTTO COMINCIÒ

Lo scienziato ungherese Bandi Balazs emigrò dall'Ungheria nel 1947. Arrivato in Svezia, iniziò a lavorare a Stoccolma sul problema del ruolo biologico dei polisaccaridi extracellulari, prestando particolare attenzione allo studio ialuronato.

In quegli anni, il lavoro sulle colture cellulari sembrava completamente diverso. Prima dell'avvento degli antibiotici, tutte le manipolazioni venivano eseguite in condizioni rigorosamente sterili, simili a quelle della sala operatoria. Le cellule sono state coltivate su coaguli di fibrina sospesi. I fibroblasti sono stati isolati da cuori di pollo schiacciati, pezzi dei quali sono stati posti su coaguli di fibrina, e il tasso di crescita della coltura è stato determinato dal cambiamento nell'area della colonia, che indicava la velocità e la distanza della migrazione cellulare.

Una delle prime scoperte fu l'isolamento dal tessuto del cordone ombelicale ialuronato per poi introdurlo nella coltura dei fibroblasti.

Ialuronato isolato dal sangue del cordone ombelicale e precipitato in alcool. È stato poi purificato dalle proteine ​​agitando l'estratto in una miscela di cloroformio e alcol isoamilico (usando il metodo Sewag). È stato fatto un tentativo di sviluppare un metodo per sterilizzare una soluzione viscosa di ialuronato. Non poteva essere filtrato, quindi gli scienziati alla fine ricorsero all'autoclavaggio.

All'inizio del lavoro sono state fatte tre osservazioni molto importanti, che hanno gettato le basi per ulteriori ricerche.

Innanzitutto, è stato possibile isolare lo ialuronato dal tessuto del cordone ombelicale e, in diverse condizioni ioniche, è stato ottenuto materiale con vari gradi di viscosità. La soluzione preparata con acqua distillata aveva la viscosità più alta. Gli scienziati hanno suggerito che la viscosità di una soluzione di ialuronato può variare a seconda del valore del pH e della forza ionica del solvente. Adesso lo sanno già tutti, ma a quel tempo questo fenomeno veniva descritto da Raymond Fuoss solo per soluzioni di polielettroliti sintetici. Il Journal of Polymer Chemistry ha pubblicato un articolo "La funzione di viscosità dell'acido ialuronico come polielettrolita". Da quel momento in poi, gli scienziati hanno iniziato a studiare da vicino le proprietà fisiche e chimiche dello ialuronato.

In secondo luogo, quando si tenta di sterilizzare lo ialuronato utilizzando i raggi UV, perde completamente la sua viscosità in soluzione. Successivamente è stato dimostrato che, quando esposto a un flusso di elettroni, anche lo ialuronato viene completamente degradato. Ora possiamo dire che questa osservazione è stata una delle prime descrizioni della scissione dei radicali liberi dello ialuronato.

In terzo luogo, sono stati studiati anche gli effetti biologici ialuronato e una serie di polisaccaridi solfati: eparina, eparan solfato (che a quegli anni era chiamato "acido eparina-monosolforico") e ialuronato sinteticamente solfato. Gli scienziati hanno confrontato i loro effetti sulla crescita delle colture cellulari, sull'attività anticoagulante e sull'attività antiialuronidasica. L'obiettivo principale era scoprire se l'eparina è davvero uno ialuronato solfato, come affermato nei lavori di Asboe-Hansen, ma si è concluso che questa affermazione era errata.

Lo ialuronato, a differenza dei polisaccaridi solfati, accelera la crescita cellulare e questa è stata forse una delle prime descrizioni dell'interazione dello ialuronato con le cellule viventi - oggi sappiamo che questa interazione è mediata da un recettore cellulare. È interessante notare che questo è stato anche uno dei primi studi ad esaminare l'attività biologica dell'eparan solfato.

Tutte le ricerche di cui sopra sono state effettuate in un breve periodo di tempo, dal settembre 1949 al dicembre 1950, ovvero in poco più di 1 anno.

SCOPERTA DELL'IALURONATO E DELLA IALURONIDASI

Karl Meyer ha aperto ialuronato nel 1934 mentre lavorava nella clinica oculistica della Columbia State University. Isolò questo composto dal corpo vitreo dell'occhio di una mucca in condizioni acide e lo chiamò acido ialuronico dal greco hyalos - acido vitreo e uronico, che faceva parte di questo polimero. Va subito detto che altri polisaccaridi (condroitin solfato ed eparina) erano stati isolati in precedenza. Inoltre, nel 1918, Levene e Lopez-Suarez isolarono un polisaccaride costituito da glucosamina, acido glucuronico e una piccola quantità di ioni solfato dal corpo vitreo e dal sangue del cordone ombelicale. Allora si chiamava acido mucoitin-solforico, ma ora è meglio conosciuto come iauluronato, che nel loro lavoro veniva isolato con una piccola miscela di solfato.

Nel corso dei successivi dieci anni, Karl Meyer e numerosi altri autori isolarono lo ialuronato da vari tessuti. Ad esempio, è stato trovato nel liquido articolare, nel cordone ombelicale e nel tessuto della cresta di gallo. La cosa più interessante fu che nel 1937 Kendall riuscì a isolare lo ialuronato dalle capsule di streptococco. Successivamente, lo ialuronato è stato isolato da quasi tutti i tessuti del corpo dei vertebrati.

Ancor prima della scoperta dello ialuronato, Duran-Reynals scoprì un certo fattore biologicamente attivo nei testicoli. Successivamente cominciò a essere chiamato “fattore di diffusione”. Il veleno delle api e delle sanguisughe medicinali aveva un effetto simile. Quando venne somministrato per via sottocutanea in miscela con inchiostro, si notò una diffusione molto rapida della colorazione nera. Questo fattore si è rivelato essere un enzima che distrugge ialuronati, che in seguito fu chiamato ialuronidasi. Anche nel sangue dei mammiferi è presente una certa quantità di ialuronidasi, ma la loro attivazione avviene solo a valori di pH acidi.

RILASCIO DI IALURONATO

Il primo metodo per isolare lo ialuronato era un protocollo standard per isolare i polisaccaridi, ovvero utilizzando il metodo Sewag o utilizzando le proteasi, tutta la proteina veniva rimossa dall'estratto. Il polimero è stato quindi precipitato in frazioni mediante aggiunta di alcol etilico.

Un grande passo avanti è stata la separazione dei polisaccaridi con carica diversa, sviluppata da John Scott mentre studiava i metodi di precipitazione con un detergente cationico (CPC, cloruro di cetilpiridinio), in cui la concentrazione del sale veniva modificata. Ialuronatoè stato separato con alta efficienza dai polisaccaridi solfatati. Questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per il frazionamento del peso molecolare. In sostanza, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando il metodo della cromatografia a scambio ionico.

STRUTTURA E CONFORMAZIONE DELLO IALURONATO

La struttura chimica della molecola del polisaccaride fu decifrata da Karl Meyer e dai suoi colleghi negli anni '50. Ora tutti sanno che lo ialuronato è una lunga molecola polimerica costituita da unità disaccaridiche, i cui componenti sono N-acetil-D-glucosamina e acido D-glucuronico, collegati da legami B1-4 e B1-3. Karl Meyer non ha utilizzato un metodo standard per studiare la struttura del polisaccaride intatto. Invece ha speso ialuronidasi scindendo il polisaccaride, producendo una miscela di disaccaridi e oligosaccaridi, che fu in grado di caratterizzare completamente. Sulla base dei risultati ottenuti, ha tratto la sua conclusione sulla possibile struttura della molecola polimerica originale.

L'analisi conformazionale delle "fibre" costituite da ialuronato è stata effettuata per la prima volta utilizzando la cristallografia a raggi X. In una conferenza tenutasi a Turku nel 1972, ci fu un acceso dibattito tra gruppi di specialisti sulla questione se lo ialuronato avesse o meno una struttura elicoidale. È ovvio che lo ialuronato può formare eliche di varie strutture a seconda della composizione ionica del solvente e della proporzione di acqua in esso contenuta. Negli anni '70 e '80 sono apparse in letteratura varie versioni della struttura dello ialuronato.

Una svolta in questo settore fu il lavoro di John Scott. Basandosi sul fatto che lo ialuronato ha una bassa reattività durante l'ossidazione della perossidasi in una soluzione acquosa, concluse che in acqua assume una conformazione con legami idrogeno intracatena. Successivamente, la sua ipotesi fu confermata dall'analisi NMR e nel 1927 Atkins e collaboratori caratterizzarono la conformazione come a doppia elica.

PROPRIETÀ FISICHE E CHIMICHE

Cinquant'anni fa non erano note la struttura chimica dello ialuronato e le sue proprietà macromolecolari: massa, omogeneità, forma molecolare, grado di idratazione e interazione con altre molecole. Negli ultimi 20 anni questo è diventato oggetto dell'attenzione di A. G. Ogston e dei suoi colleghi a Oxford, del Dr. Balazs e colleghi a Boston, di Torvard C. Laurent che lavora a Stoccolma e di molti altri laboratori.

Il problema principale era l'isolamento dello ialuronato, purificato dalle proteine ​​e da altri componenti, che doveva essere effettuato prima di qualsiasi metodo di ricerca fisica. Esiste sempre il rischio di degradazione della struttura polimerica durante il processo di purificazione. Ogston utilizzò la tecnica dell'ultrafiltrazione, partendo dal presupposto che le proteine ​​libere avrebbero superato il filtro e le proteine ​​si sarebbero legate ialuronato, sarà ritardato dal filtro. L'oggetto dello studio era un complesso con un contenuto proteico del 30%. Altri autori hanno provato a utilizzare una varietà di metodi di purificazione fisica, chimica ed enzimatica, che hanno permesso di ridurre il contenuto proteico di diversi punti percentuali. Allo stesso tempo, i risultati dell’analisi fisico-chimica hanno fornito una descrizione più completa della molecola ialuronato. Il suo peso molecolare è vicino a diversi milioni, sebbene la dispersione tra i campioni fosse piuttosto elevata. La diffusione della luce ha mostrato che la molecola si comporta come una catena attorcigliata in modo casuale, abbastanza densamente compattata con un raggio di curvatura di circa 200 nm. L'impaccamento e la bassa mobilità della catena sono associati alla presenza di legami idrogeno intracatena, già menzionati sopra. La struttura attorcigliata in modo casuale corrisponde pienamente al rapporto ottenuto tra viscosità e peso molecolare della sostanza. Ogston e Stanier hanno utilizzato metodi di sedimentazione, diffusione, velocità di taglio, separazione del gradiente di viscosità e metodi di birifrangenza per dimostrare che la molecola di ialuronato ha la forma di una sfera altamente idratata, il che è coerente con le proprietà note delle molecole con impaccamento sotto forma di un involucro casuale. elica contorta.

TECNICHE ANALITICHE

L’unico modo possibile per studiare quantitativamente l’acido ialuronico era isolare il polisaccaride nella sua forma pura e misurare il contenuto di acido uronico e/o N-acetilglucosamina in esso contenuto. I metodi scelti in questo caso sono stati il ​​metodo Dische del carbazolo per valutare il contenuto di acido uronico e la reazione di Elson-Morgan per i livelli di esosamina.

In questo caso, è difficile sopravvalutare l'importanza dell'utilizzo del metodo carbazolo. Quando si analizzava lo ialuronato, a volte era necessario utilizzare milligrammi della sostanza.

Il passo successivo è stata la scoperta di enzimi specifici. Ialuronidasi fungina Streptomiceti ha agito solo su ialuronato, in questo caso si sono formati esa- e tetrasaccaridi insaturi. Quando si analizza il contenuto ialuronato Questa proprietà dei funghi potrebbe essere sfruttata, soprattutto in presenza di altri polisaccaridi e impurità nel mezzo, e la forma insatura dell'acido ialuronico potrebbe essere utilizzata per ridurre il limite di rilevazione del prodotto. Il metodo enzimatico ha aumentato significativamente la sensibilità del rilevamento dello ialuronato fino al livello del microgrammo.

L'ultimo passo è stato l'uso di proteine ​​di affinità che si legano specificamente allo ialuronato. Tengblad ha utilizzato proteine ​​che legano lo ialuronato dalla cartilagine e Delpech ha inoltre utilizzato la ialuronectina isolata dal cervello. Queste proteine ​​possono essere utilizzate in analisi simili ai metodi immunologici e, dopo lo sviluppo di questo metodo, l'accuratezza della quantificazione ialuronato aumentato al livello del nanogrammo, il che ha permesso di determinarne il contenuto ialuronato in campioni di tessuto e fluidi fisiologici. Il metodo Tengblad divenne la base per gran parte del lavoro successivo di Uppsala.

VISUALIZZAZIONE DELLO IALURONATO

Il rilevamento dello ialuronato nelle sezioni di tessuto è strettamente correlato all'analisi dei polimeri nel fluido tissutale. Fin dall'inizio sono stati utilizzati metodi di colorazione non specifici con coloranti standard. John Scott è riuscito ad aumentare la specificità utilizzando lo stesso principio che ha guidato lo sviluppo del metodo per il frazionamento dei polisaccaridi anionici nei detergenti. Li ha colorati con colorante blu alcian in diverse concentrazioni ioniche ed è stato in grado di ottenere una colorazione distinguibile di diversi polisaccaridi. Successivamente è passato al blu cupromerone.

Allo stesso tempo, lo ialuronato può essere chiaramente rilevato su sezioni di tessuto utilizzando proteine ​​che si legano specificamente ad esso. I primi resoconti di questo metodo furono pubblicati nel 1985. Questo metodo è stato utilizzato con grande successo e grazie ad esso sono stati ottenuti dati preziosi sulla distribuzione del contenuto di ialuronato in diversi organi e tessuti.

Ialuronato può essere rilevato anche mediante microscopia elettronica. Nelle prime immagini pubblicate da Jerome Gross, purtroppo, non è stato possibile vedere nessun dettaglio della struttura. Il primo lavoro che ha spiegato bene i risultati è stato l'articolo di Fessler e Fessler. Si afferma che lo ialuronato ha una struttura estesa a catena singola.

Robert Fraser descrisse poi un altro metodo elegante per visualizzare il pericellulare ialuronato. Ha aggiunto una sospensione di particelle di ialuronato a una coltura di fibroblasti. Non sono state rilevate particelle nello spesso strato che circonda la coltura di fibroblasti. Pertanto, è stato dimostrato che nello spazio pericellulare è presente lo ialuronato, che è soggetto a scissione sotto l'azione della ialuronidasi.

ELASTICITÀ E REOLOGIA

Basato sulla dimensione di una delle molecole più grandi ialuronato, è facile supporre che ad una concentrazione di circa 1 g/l saturano quasi completamente la soluzione. Ad alte concentrazioni, le molecole si aggrovigliano e la soluzione è una sorta di rete di catene di ialuronato. Il punto di polimerizzazione è determinato abbastanza facilmente: questo è il momento di saturazione della soluzione, dopo di che la sua viscosità aumenta bruscamente all'aumentare della concentrazione. Un'altra proprietà di una soluzione che dipende dalla sua concentrazione è la velocità di spostamento della viscosità. Questo fenomeno è stato descritto da Ogston e Stanier. Le proprietà elastiche della soluzione cambiano all'aumentare della concentrazione e del peso molecolare dei polimeri. Fluidità di puro ialuronatoè stato determinato per la prima volta da Jensen e Koefoed, e un'analisi più dettagliata della viscosità e dell'elasticità della soluzione è stata eseguita da Gibbs et al.

Questo interessante comportamento della soluzione è una conseguenza dell'intreccio puramente meccanico delle catene polimeriche o è anche legato alla loro interazione chimica? I primi lavori pubblicati da Ogston discutevano le possibili interazioni mediate dalle proteine. Welsh e colleghi hanno ricevuto indicazioni dell'esistenza di interazioni tra catene. Ciò è stato ottenuto aggiungendo alla soluzione corte catene di ialuronato (60 disaccaridi), che hanno causato una diminuzione della sua elasticità e viscosità. Ovviamente c'era un'interazione competitiva tra filiere corte e lunghe. Il lavoro successivo di John Scott ha mostrato che la conformazione dello ialuronato con legami idrofobici tra le catene era ben coerente con la tendenza dello ialuronato a formare eliche con molecole vicine che erano stabilizzate da legami idrofobici. Pertanto, la più probabile è l'interazione intercatena, che determina in gran parte le proprietà reologiche ialuronato.

RUOLO FISIOLOGICO DEI POLIMERI IALURONICI

Catene di tessitura di apertura ialuronato le crescenti concentrazioni che possono verificarsi nei tessuti hanno portato a supporre che lo ialuronato possa essere coinvolto in molti processi fisiologici creando una grande rete tridimensionale di catene. È stata discussa un'ampia varietà di proprietà di tali reti.

Viscosità. La viscosità molto elevata delle soluzioni concentrate di ialuronato, nonché la dipendenza del taglio dalla viscosità, possono essere utilizzate per la lubrificazione delle articolazioni. Lo ialuronato è sempre presente in tutti gli spazi che separano gli elementi in movimento del corpo - nelle articolazioni e tra i muscoli.

Pressione osmotica. Pressione osmotica delle soluzioni ialuronato dipende in gran parte dalla loro concentrazione. Ad alte concentrazioni, la pressione colloido-osmotica di tale soluzione è superiore a quella delle soluzioni di albumina. Questa proprietà può essere utilizzata nei tessuti per mantenere l'omeostasi.

Resistenza al flusso. Una fitta rete di catene costituisce una barriera abbastanza buona al flusso del fluido. Ialuronato possono effettivamente formare ostruzioni al flusso dei liquidi nei tessuti, come dimostrato per la prima volta da Day.

Volume escluso. La rete tridimensionale di catene sposta tutte le altre macromolecole dalla soluzione. Il volume disponibile può essere misurato mediante equalizzazione dialitica di una soluzione di ialuronato e di una soluzione tampone e l'effetto ottenuto è risultato coincidere con quello calcolato dagli studi teorici effettuati da Ogston. L'effetto di esclusione è stato discusso in relazione alla ripartizione delle proteine ​​contenute nel letto vascolare e nello spazio extracellulare, ma è stato anche considerato come un meccanismo di accumulo di molecole fisiologiche e patologiche nel tessuto connettivo. L'esclusione dei polimeri riduce la solubilità di molte proteine.

Barriera alla diffusione. Movimento delle macromolecole attraverso la soluzione ialuronato può essere misurato mediante analisi di sedimentazione e diffusione. Più grande è la molecola, minore è la velocità del suo movimento. Questo effetto è stato associato alla formazione di barriere di diffusione nei tessuti. Ad esempio, lo strato pericellulare di ialuronato può proteggere le cellule dagli effetti delle macromolecole rilasciate da altre cellule.

PROTEINE CHE LEGANO L'IALURONE (HYALADERINE)

Proteoglicani. Fino al 1972 si credeva che lo ialuronato fosse un composto inerte e non interagisse con altre macromolecole. Nel 1972 Hardingham e Muir lo dimostrarono ialuronato possono legarsi ai proteoglicani del tessuto cartilagineo. Studi di Hascall e Heinegard hanno dimostrato che lo ialuronato può legarsi specificamente al dominio N-terminale della porzione globulare dei proteoglicani e delle proteine ​​di giunzione. Questo legame è piuttosto forte e diversi proteoglicani possono attaccarsi a una catena di ialuronato, provocando la formazione di grandi aggregazioni di molecole nella cartilagine e in altri tessuti.

Recettori dello ialuronato. Nel 1972, Pessac e Defendi e Wasteson et al hanno dimostrato che le sospensioni di alcune cellule iniziano ad aggregarsi quando viene aggiunto lo ialuronato. Questo è stato il primo rapporto che indicava un legame specifico ialuronato con la superficie delle cellule. Nel 1979 Underhill e Toole lo dimostrarono ialuronato si lega effettivamente alle cellule e nel 1985 fu isolato il recettore responsabile di questa interazione. Nel 1989, due gruppi di autori pubblicarono articoli che mostravano che il recettore CD44 homing dei linfociti ha la capacità di legarsi allo ialuronato nel tessuto cartilagineo. Fu presto dimostrato che il recettore isolato da Underhill e Toole era completamente identico al CD44. Ancora uno ialuronato La proteina legante, successivamente isolata dal surnatante della coltura cellulare 3T3 nel 1982 da Turley et al., si è rivelata essere GHRP (recettore della motilità dell'ialuronato). Dopo questi lavori furono scoperte tutta una serie di ialaderine.

RUOLO DELLO IALURONATO NELLA CELLULA

Fino alla scoperta delle ialaderine si credeva che lo ialuronato avesse un effetto sulle cellule solo attraverso interazioni fisiche. I dati secondo cui lo ialuronato può svolgere un ruolo nei processi biologici erano sporadici e, per la maggior parte, si basavano sull'assenza o sulla presenza di ialuronato in vari processi biologici. Gran parte delle speculazioni dell'epoca si basavano su tecniche di colorazione istologica non specifica.

Uno studio molto interessante fu condotto a Boston all’inizio degli anni ’70. Bryan Toole e Jerome Gross lo hanno dimostrato durante la rigenerazione degli arti nei girini ialuronato viene sintetizzato all'inizio, quindi la sua quantità diminuisce sotto l'azione della ialuronidasi e lo ialuronato viene sostituito dal condroitin solfato. Gli eventi si sviluppano allo stesso modo durante la formazione della cornea in un pollo. Toole ha sottolineato che l'accumulo di ialuronato coincide con periodi di migrazione cellulare nei tessuti. Come accennato in precedenza, Toole ha anche condotto i primi studi sulle ialaderine legate alla membrana e con la scoperta dei recettori dello ialuronato abbiamo più motivi per credere che ialuronato svolge un ruolo nella regolazione dell'attività cellulare, ad esempio durante il movimento cellulare. Negli ultimi 10 anni si può osservare un aumento del numero di pubblicazioni dedicate al ruolo dello ialuronato nella migrazione cellulare, nella mitosi, nell’infiammazione, nella crescita tumorale, nell’angiogenesi, nella fecondazione, ecc.

BIOSINTESI DELLO IALURONATO

Gli studi sulla biosintesi dello ialuronato possono essere suddivisi in 3 fasi. Il primo autore e scienziato più importante della prima fase fu Albert Dorfman. All'inizio degli anni '50, lui e i suoi colleghi descrissero la fonte dei monosaccaridi incorporati nelle catene ialuroniche degli streptococchi. Nel 1955, Glaser e Brown dimostrarono per primi la possibilità della sintesi dello ialuronato mediante un sistema sintetico separato all'esterno della cellula. Hanno utilizzato un enzima isolato dalle cellule del sarcoma di Rous del pollo e hanno introdotto l'acido glucuronico UTP marcato con 14C nella composizione degli oligosaccaridi ialuronici. Il gruppo Dorfman ha anche isolato le molecole precursori dell'acido glucuronico UTP e dell'UTP-N-acetilglucosamina dall'estratto streptococcico e ha anche sintetizzato ialuronato, utilizzando una frazione enzimatica isolata da streptococchi.

Nella seconda fase è diventato chiaro che lo ialuronato deve essere sintetizzato attraverso un percorso diverso da quello dei glicosaminoglicani. La sintesi dello ialuronato, a differenza dei polisaccaridi solfati, non richiede la sintesi proteica attiva. La sintasi responsabile di ciò si trova nella membrana protoplastica dei batteri e nella membrana plasmatica delle cellule eucariotiche, ma non nell'apparato di Golgi. L'apparato sintetico è presumibilmente situato sul lato interno della membrana, poiché si è rivelato insensibile agli effetti delle proteasi extracellulari. Inoltre, la catena ialuronica penetra nella membrana, poiché l’esposizione delle cellule alla ialuronidasi ne aumenta la produzione. ialuronato. Negli anni '80 furono fatti diversi tentativi infruttuosi per isolare la sintasi dalle cellule eucariotiche.

All'inizio degli anni '90 è stato dimostrato ialuronato-sintasi è un fattore di virulenza per gli streptococchi di gruppo A. Utilizzando questi dati come base, due gruppi di autori sono stati in grado di identificare il gene e il locus responsabile della sintesi della capsula ialuronica. Ben presto è stato possibile clonare il gene di questa sintasi e sequenziarlo completamente. Proteine ​​omologhe isolate negli ultimi anni da tutti i vertebrati hanno fornito preziose informazioni sulla sua struttura. Un'importante area di ricerca potrebbe essere lo studio dei meccanismi che regolano l'attività di questa sintasi.

METABOLISMO E DEGRADAZIONE DELLO IALURONATO

La scoperta dello ialuronato nel sangue e del suo trasporto dai tessuti attraverso il sistema linfatico è diventata la base per uno studio congiunto condotto dal dottor Robert Fraser a Melbourne e da un laboratorio a Uppsala. Tracce del polisaccaride marcato con trizio acetile sono state trovate nel sangue dopo la somministrazione a conigli e esseri umani e l'etichetta del composto è scomparsa con un'emivita di diversi minuti. Ben presto divenne chiaro che la maggior parte delle radiazioni si accumulava nel fegato, dove il polimero veniva rapidamente scomposto. Dopo 20 minuti è stata rilevata acqua marcata con trizio nel sangue. Gli autoradiogrammi hanno mostrato che l’accumulo di radiazioni si è verificato anche nella milza, nei linfonodi e nel midollo osseo. Il frazionamento cellulare ha inoltre dimostrato che nel fegato l'accumulo si verifica principalmente nell'endotelio del seno, il che è stato successivamente confermato da studi in vitro e dalla radiografia in situ. Queste cellule hanno un recettore per l'endocitosi dello ialuronato, che è fondamentalmente diverso dalle altre proteine ​​che legano lo ialuronato. Il polisaccaride viene poi scomposto nei lisosomi. Sono stati condotti studi sullo ialuronato in altri tessuti e ora esiste un quadro completo del metabolismo di questo polisaccaride.

Recentemente, un altro aspetto del catabolismo ialuronatoè diventato oggetto di un gran numero di studi. Dal lavoro di Gunther Kreil (Austria) e Robert Stern e dei suoi colleghi (San Francisco), sono diventate note le strutture e le proprietà di varie ialuronidasi. Questi dati sono diventati la base per studi che hanno chiarito il ruolo biologico di questi enzimi.

IALURONATO PER VARIE MALATTIE

Fin dall'inizio, l'interesse degli scienziati si è concentrato sulle proprietà dello ialuronato contenuto nel liquido articolare, in particolare sui cambiamenti del suo livello nelle malattie delle articolazioni. È stato anche dimostrato che la sovrapproduzione di ialuronato è osservata in una serie di malattie, ad esempio nei tumori maligni - mesoteliomi, ma a quel tempo non esistevano metodi sufficientemente accurati e sensibili per rilevare lo ialuronato. Questa situazione persistette fino agli anni '80, quando furono sviluppate nuove tecniche analitiche, che attirarono ancora una volta l'interesse scientifico per le fluttuazioni del contenuto di ialuronato per varie malattie. Il contenuto di ialuronato nel sangue è stato determinato in condizioni normali e patologiche, soprattutto nella cirrosi epatica. Nell'artrite reumatoide, il contenuto di ialuronato nel sangue aumenta durante l'attività fisica, soprattutto al mattino, il che spiega il sintomo della “rigidità mattutina” delle articolazioni. In varie malattie infiammatorie, il livello di ialuronato nel sangue aumenta sia a livello locale che sistemico. La disfunzione d'organo potrebbe anche essere spiegata dall'accumulo di ialuronato, che ha causato edema del tessuto interstiziale.

APPLICAZIONE CLINICA

L'importante passo avanti nell'uso medico dello ialuronato è interamente dovuto al Dr. Balazs. Sviluppò i principi e le idee di base, fu il primo a sintetizzare una forma di ialuronato ben tollerata dai pazienti, promosse l'idea della produzione industriale di ialuronato e rese popolare l'idea di utilizzare i polisaccaridi come medicinali.

Negli anni '50 Balazs concentrò i suoi sforzi sullo studio della composizione del corpo vitreo e iniziò a condurre esperimenti con sostituti di eventuali protesi nel trattamento del distacco di retina. Uno degli ostacoli più seri all’uso delle protesi ialuroniche è stata l’elevata difficoltà di isolare lo ialuronato puro, libero da tutte le impurità che causano una reazione infiammatoria.

Balazs risolse questo problema e il farmaco risultante fu chiamato NVF-NaGU (frazione non infiammatoria ialuronato sodio). Nel 1970, lo ialuronato fu iniettato per la prima volta nelle articolazioni di cavalli da corsa affetti da artrite e si ottenne una risposta clinicamente significativa al trattamento con una diminuzione dei sintomi della malattia. Due anni dopo, Balazs riuscì a convincere la direzione della Pharmacia AB di Uppsala a iniziare a produrre ialuronato per l'uso nella pratica clinica e veterinaria. Miller e Stegman, su consiglio del dottor Balazs, iniziarono a utilizzare lo ialuronato nelle lenti intraoculari impiantabili e lo ialuronato divenne rapidamente uno dei componenti più comunemente usati in oftalmologia chirurgica, ricevendo il nome commerciale Healon®. Da allora sono stati proposti e testati molti altri usi dello ialuronato. I suoi derivati ​​(ad esempio, a struttura incrociata ialuronati) sono stati testati anche per l'uso clinico. Vorrei in particolare sottolineare che già nel 1951 Balazs riferiva sull'attività biologica dei primissimi derivati ​​​​dell'ialuronato ottenuti a quel tempo.

CONCLUSIONE

In questo rapporto siamo riusciti a coprire solo gli eventi principali e più significativi nella storia della ricerca sullo ialuronato e molti altri fatti e dati interessanti saranno discussi sul nostro sito web. Dagli articoli presentati sarà chiaro che la ricerca sullo ialuronato sta diventando sempre più rilevante e necessaria. Oggi nella letteratura scientifica vengono pubblicati ogni anno dai 300 ai 400 articoli ialuronato.

Il primo congresso internazionale interamente dedicato allo ialuronato si tenne a Saint-Tropez nel 1985, seguito dai congressi di Londra (1988), Stoccolma (1996) e Padova (1999).

La crescita di interesse è in gran parte dovuta al lavoro di successo di Endre Balazs, che ha fatto molto nel campo della ricerca sulle proprietà dello ialuronato, ha ottenuto i primi dati su di esso e ha sottolineato la possibilità di un uso clinico ialuronato ed è fonte di ispirazione, spingendo la comunità scientifica verso nuove ricerche.